Белковая инженерия. Направленная модификация белков

Словарь Элюция Элюция – метод извлечения вещества (вируса) из твердого носителя вымыванием Методдисплея Метод дисплея – метод представления гетерологичных белков/ пептидов на поверхности вирусов, клеток или бесклеточных культур для отбора белков или пептидов с требуемыми свойствами Биосенсор Биосенсор – аналитическая система (биологический материал + преобразователь), позволяющая обнаруживать вещества в исследуемой пробе и оценивать их концентрации Элюция Элюция – метод извлечения вещества (вируса) из твердого носителя вымыванием Методдисплея Метод дисплея – метод представления гетерологичных белков/ пептидов на поверхности вирусов, клеток или бесклеточных культур для отбора белков или пептидов с требуемыми свойствами Биосенсор Биосенсор – аналитическая система (биологический материал + преобразователь), позволяющая обнаруживать вещества в исследуемой пробе и оценивать их концентрации

Белковая инженерия 4 Комплекс методов и подходов по изучению белков и получению белков с новыми свойствами ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ Создать клонотеку нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Исследовать влияния одиночных замен аминокислотных остатков на фолдинг и функции белка Разработать методы эффективной модификации белков для придания им необходимых свойств Разработать методы и подходы для скрининга и отбора белков с требуемыми свойствами

Рациональныйдизайн Рациональный дизайн Необходимость знаний о пространственной организации белка Необходимость знаний о внутри- и межмолекулярных взаимодействиях Несовершенство методик и аппаратуры направление, нацеленное на создание новых белков de novo путем их пространственного конструирования

Направленная эволюция белковых молекул направление, нацеленное на создание новых белков, посредством селекции 1 получение клонотек случайных аминокислотных последовательностей 2 отбор полипептидных цепей, обладающих хотя бы в небольшой степени требуемыми свойствами 3 с использованием случайного мутагенеза получение новых клонотек белков, которые применяют в следующем раунде селекции или с использованием генно-инженерных конструкций, экспрессирующих новые белки

Направленная эволюция белковых молекул (варианты) рациональный редизайн с помощью направленного мутагенеза заменяют конкретные аминокислотные остатки в активном центре фермента инженерия белковых поверхностей с помощью мутаций изменяют участки полипептидной цепи в окрестностях аминокислотных остатков, сближенных на поверхности белковой глобулы, но находящихся в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга

Скрининг и отбор белков с заданными свойствами случайный скрининг улучшенный скрининг отбор каждый белок исследуется на наличие требуемых свойств; выбор белков из клонотеки происходит случайно каждый белок исследуется на наличие требуемых свойств; выбор белков из клонотеки происходит случайно возможен, если объекты, составляющие клонотеку, различаются фенотипически (например, по наличию ферментативной активности) создаются условия для избирательного сохранения компонентов клонотеки, которые обладают определенными свойствами (фаговый, клеточный дисплей) создаются условия для избирательного сохранения компонентов клонотеки, которые обладают определенными свойствами (фаговый, клеточный дисплей) обнаружение белка с требуемыми свойствами среди большого числа макромолекул, составляющих полученную клонотеку

Фаговый дисплей Цель – экспонировать чужеродные белки на поверхности фага Метод был разработан в 1985 г. для нитчатого бактериофага М13. (гены pIII и pVIII являются пригодными сайтами мишенями для вставки чужеродного кДНК фрагмента) Цель – экспонировать чужеродные белки на поверхности фага Метод был разработан в 1985 г. для нитчатого бактериофага М13. (гены pIII и pVIII являются пригодными сайтами мишенями для вставки чужеродного кДНК фрагмента) конструируют гибридный ген, состоящий из кодирующих последовательностей целевого белка и одного из белков оболочки фага бактериофагом инфицируют E.coli в ходе сборки фага гибридные белки включаются в фаговую частицу

Фагмида Фаг-помощник Геном фага Инфицирование E.coli фагом-помощником клетки E.coli, трансформированные плазмидной библиотекой / фагмидой, инфицируют хелперным фагом для получения фаговых частиц, на поверхности которых экспонированы различные варианты целевого белка клетки E.coli, трансформированные плазмидной библиотекой / фагмидой, инфицируют хелперным фагом для получения фаговых частиц, на поверхности которых экспонированы различные варианты целевого белка

Перспективы практического использования белковой инженерии Медицина: *для получения новых лекарственных препаратов; для создания диагностических средств и производства вакцин; *для исследование механизмов иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы Экология: *для получение биокатализаторов в виде целых клеток с иммобилизованными на их поверхности ферментами; *для получения биосенсоров с целью диагностики и мониторинга окружающей среды; *для создание био адсорбентов с целью удаления из окружающей среды токсических веществ и ионов тяжелых металлов

Измерение глюкозы с помощью ферментного электрода (схематическое представление опыта Л. Кларка). Окисление глюкозы ферментом глюкозооксидазой в присутствии кислорода: глюкоза + О 2 Н 2 О 2 + глюконо-1,5-лактон. Н 2 О 2 восстанавливается на платиновом электроде при потенциале +700 мВ; протекающий в цепи ток пропорционален концентрации пероксида водорода (т.е., косвенно, глюкозы).

Словарь Иммобилизация Иммобилизация – это ограничение подвижности молекул и их конфирмационных перестроек Аэротенк Аэротенк – система очистки стоков, резервуары в которых происходит перемешивание СВ, микробного ила и воздуха Метантенк Метантенк – резервуар для биологической переработки органических загрязнителей с помощью бактерий в анаэробных условиях Биоремедиация Биоремедиация – комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов – растений, грибов, насекомых, червей и других организмов Иммобилизация Иммобилизация – это ограничение подвижности молекул и их конфирмационных перестроек Аэротенк Аэротенк – система очистки стоков, резервуары в которых происходит перемешивание СВ, микробного ила и воздуха Метантенк Метантенк – резервуар для биологической переработки органических загрязнителей с помощью бактерий в анаэробных условиях Биоремедиация Биоремедиация – комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов – растений, грибов, насекомых, червей и других организмов

Классификация ферментов Класс Катализируемые реакции Примеры ферментов Оксидо- редуктазы Восстановительные и окислительные реакции Известно более 200 ферментов. Каталаза, глюкооксидаза Трансфе- разы Обратимый перенос групп атомов от доноров к акцепторам. Известно более 450 ферментов. Пируваткиназа, протеинкиназа Гидролазы Реакции гидролиза Известно более 200 гидролаз. Протеаза, амилаза, целлюлаза Лиазы Негидролитического отщепления от субстрата групп атомов с образованием двойных связей Известно более 100 лиаз. Аспартаза, фумараза Изомеразы Внутримолекулярные реакции перестройки органических соединений Известно более 50 ферментов. Глюкозоимераза Лигазы Реакции присоединения друг к другу двух различных молекул Известно более 100. ДНК-лигаза, триптофан-синтетаза

Микроорганизмы Источники ферментов Бациллы – био синтезаторы рибонуклеаз, дезоксирибонуклеаз и протеаз, а дрожжи – глюкоамилаз, инвертаз и кислой фос-фатазы растения Амилазы выделяют из ячменя, кислую фосфатазу из картофеля, пероксидазу из хрена животные Из сердца КРС выделяют лактатдегидрогеназу, из желудка – щелочную фосфатазу. Желудок свиней используют для получения пепсина Из сердца КРС выделяют лактатдегидрогеназу, из желудка – щелочную фосфатазу. Желудок свиней используют для получения пепсина

Методы иммобилизации Физические методы Химические методы адсорбция на нерастворимом носителе, включение в поры геля, пространственное отделение с помощью полупроницаемой мембраны и другие основывается на создании новых ковалентных связей между ферментом и носителем

Преимущества иммобилизованных ферментов отделять ферменты от реакционной среды, останавливать реакцию в нужный момент и получать продукт не загрязненный ферментом; проводить процесс в непрерывном режиме и регулировать скорость реакции; изменять свойства катализатора, его специфичность, зависимость от условий реакции и чувствительность к денатурирующим воздействиям; регулировать каталитическую активность фермента посредством воздействия на носитель

Ферменты в биотехнологическом производстве Фермент Источник, метод иммобилизации Биотехнология Ацетилнейтраминат -9-фосфатсинтаза Фермент E. coli. Включение в полиакриламидный гель. Синтез сиаловых кислот. Пероксидаза Фермент из хрена. Сополимеризация и включение в гель альгината. Окисление фенола в сточных водах. 3-Кетостероид- дегидрогеназа Клетки Mycobacterium globiformis. Включение в полиакриламидный гель. Трасформация гидрокортизона в преднизолон

Лавряшина М.Б. КемГУ Методы экологической биотехнологии Биологическая очистка сточных вод Био(фито)ремедиация Созданиебиобезопасныхинсектицидови гербицидов Создание биобезопасных инсектицидов и гербицидов Получение экологически чистой энергии Создание сельскохозяйственных растений устойчивых к болезням Бактериальное выщелачивания металлов Клонирование исчезающих и вымерших видов животных

Методы очистки сточных вод Механические (отстаивание, фильтрация)Механические Химические (воздействие реагентами)Химические Физико- химические Биологические (биохимическое самоочищение))Биологические Важнейшая проблема биотехнологии – очистка сточных вод

Аэротенки работают в комплексе с усреднителем, отстойниками, регенератором ила и уплотнителем ила (пресс). Аэротенк Аэротенк (от аэро и англ. tank бак, цистерна) отстойник усреднитель АЭРОТЕНК регенератор ила пресс очищенные сточные воды активный ил сточные воды метантенк

Метантенк Метантенк (от метан и англ. tank – бак, цистерна) Группы бактерий Исходные вещества Продукты ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ АЦЕТОГЕННЫЕ Органические загрязнители Высшие жирные кислоты ВОДОРОДОПРОДУЦИ- РУЮЩИЕ Высшие жирные кислоты Н 2,СО 2, СН 3 СООН МЕТАНОБРАЗУЮЩИЕ Н 2,СО 2, СН 3 СООН СН 4, СО 2

Фазы метанового брожения 1 биогидролиз полимеров и ацидогенез (органические вещества переходят в высшие жирные кислоты, ацетат и водород) 2 ацетогенез и дегидрогенизация (из высших жирных кислот образуется ацетат и водород) 3 Метаногенез (из ацетата образуется метан, водород и углекислый газ)

I фаза. ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗРУШАЮЩИЕ (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ (Clostridium, Petrococcus) II фаза. АЦЕТОГЕННЫЕ (Syntrophobacter wolinii) III фаза. МЕТАНООБРАЗУЮЩИЕ (Metanobacterium thermoautotrophicum, Metanococcus vannielii) Примеры микроорганизмов

БИОРЕМЕДИАЦИЯ В основе метода лежит способность микроорганизмов утилизировать сложные органические вещества с разложением их до простых «биологически безопасных» веществ Молекулярная биология и генетика Экология Инженерные науки Микро- биологияБИОРЕМЕДИАЦИЯ

Биоремедиация. Подходы. Использование активности природных «диких» микроорганизмов Использование активности природных «диких» микроорганизмов (требуется интенсификатор, например О 2) Использование активных штаммов, внесенных в виде биопрепаратов в места интенсивных загрязнений

Изучение биоразнообразия загрязненных территорий Выделение микрофлоры, способной к деструкции удаляемых загрязнителей Активизация местной микрофлоры (биостимуляция). Интродукция в загрязненные участки специальных микроорганизмов- деструкторов (биоремедиация) Биоремедиация. Этапы.

ЗАГРЯЗНЕНИЯ Химический анализ Инженерные технологии Биостимуляция (Природные микробные сообщества)Биостимуляция Биоремедиация (Искусственные микробные биопрепараты)Биоремедиация Мониторинг биоремедиации Биофиторемедиация (Сообщества растений и микроорганизмов)Биофиторемедиация

Конструирования трансгенных растений, устойчивых против насекомых вредителей 1. СИНТЕЗ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ 2. СИНТЕЗ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, ДЕЙСТВУЩИХ НА КЛЕТОЧНЫЕ СТЕНКИ ЛИЧИНОК НАСЕКОМЫХ И ДРУГИХ ВРЕДИТЕЛЕЙ И ПАТОГЕНОВ /ХИТИНАЗА, -1,3- ГЛЮКОНАЗЫ, РR-БЕЛКИ/ 3. СИНТЕЗ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ И ИНГИБИТОРОВ ФЕРМЕНТОВ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПОЛИСАХАРИДЫ РАСТЕНИЯ 4. МОДИФИКАЦИЯ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА РАСТЕНИЙ ДЛЯ: А) ЛИМИТИРОВАНИЯ НЕОБХОДИМЫХ ВЕЩЕСТВ Б) СИНТЕЗА НОВЫХ РЕПЕЛЛЕНТОВ И ТОКСИНОВ 5. РЕГУЛЯЦИЯ ЗАЩИТНОГО ОТВЕТА: А) ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Б) РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РАЗЛИЧНЫМИ ЕСТЕСТВЕННЫМИ И ИСКУССТВЕННЫМИ ФАКТОРАМИ Повышенная устойчивость трансгенных растенийк грибному патогену Phomopsis helianhi Повышенная устойчивость трансгенных растений к грибному патогену Phomopsis helianhi А B А - нетрансгенное растение В - трансгенное растение А - нетрансгенное растение В - трансгенное растение

Примерный список тем, входящий в тест на зачете 1. История биотехнологии. Характеристика исторических периодов. Наиболее значимые открытия, сыгравшие важную роль в становлении науки. 2. Общие понятия биотехнологии: биотехнологическая система, биотехнологический процесс, биотехнологический объект. 3. Биотехнологические объекты, определение, характеристика места биообъекта в биотехнологической системе, классификация, примеры практического применения. 4. Микроорганизмы как биообъекты. Примеры, практическое использование в биотехнологиях. 5. Культуры клеток и тканей как биообъекты. Примеры, практическое использование в биотехнологиях. 6. Биотехнологический процесс. Этапы. Краткая характеристика этапов биотехнологического процесса. 7. Характеристика микроорганизмов как объектов селекции. Селекция микроорганизмов в биотехнологии. 8. Мутагенез: определение, формы мутагенеза, мутагенные факторы. 9. Отбор мутантных микроорганизмов созданных в процессе селекции на подготовительной стадии биотехнологического процесса. 10. Селекция биообъектов. Этапы, подходы, методы.

11. Генетическая инженерия: цель, техника, биообъекты, примеры практического применения, современные достижения. 12. Ферменты генетической инженерии. Классификация, характеристика катализируемых реакций. 13. Методы получения гена в генетической инженерии. Краткая характеристика, достоинства и недостатки методов. 14. Вектора в генетической инженерии. Определение, классификации, требования, краткая характеристика векторов. 15. Рекомбинантная ДНК. Определение, назначение, методы получения рекомбинантной ДНК в генетической инженерии. 16. Методы введения рекомбинантной ДНК в клетку-реципиент и отбор модифицированных клеток в генетической инженерии. 17. Трансгенез растений. Вектора. Основные стратегии. Методы введения трансгенов и отбора трансгенных организмов. 18. Трансгенез животных. Вектора. Основные стратегии. Методы введения трансгенов и отбора трансгенных организмов. 19. Клеточная инженерия: цель, техника, биообъекты, примеры практического применения, современные достижения. 20. Методы культивирования клеток и тканей растений. Условия культивирования, классификация и краткая характеристика культур растений в клеточной инженерии

21. Соматические гибриды растений. Техника получения, современные достижения, примеры практического применения. 22. Протопласты: определение, использование в клеточной инженерии, методы и условия выделения протопластов. 23. Культивирование и слияние протопластов в клеточной инженерии. Методы, условия, фьюзогены. 24. Практическое использование культур клеток и тканей растений. Биосинтез и биотрансформация, микроразмножение, примеры трансгенных растений с ценными свойствами. 25. Клеточная инженерия животных. Методы, объекты, техника, современные достижения, практическое применение. 26. Клеточные и тканевые культуры животных. Классификации культур, условия культивирования, среды, методы получения соматических гибридов, практическое применение. 27. Стволовые клетки. Характеристика. Классификация. Перспективы применения. 28. Клонирование. Характеристика метода. Классификация. Перспективы применения. 29. Биотехнологический процесс. Стадия культивирования. Основные этапы, характеристика сред для микроорганизмов, клеток растений и животных. Аппаратура. 30. Биотехнологический процесс. Стадия культивирования. Режимы культивирования биообъектов. Стадии роста культуры в биореакторе, синтез целевого продукта.

31. Биотехнологический процесс. Стадия получения продукта. Основные этапы и методы отделения и очистки биотехнологического продукта. Примеры биотехнологических продуктов. 32. Экологическая биотехнология: цель, методы, биообъекты, примеры практического применения, современные достижения. 33. Экологическая биотехнология. Проблема питьевой воды. Аэробные методы очистки сточных вод. 34. Экологическая биотехнология. Проблема питьевой воды. Анаэробные методы очистки сточных вод. 35. Экологическая биотехнология. Биоремедиация, биофиторемедиация. 36. Биотехнология: цель, предмет, задачи, основные направления биотехнологии. Современные достижения в области биотехнологии. 37. Инженерная энзимология. Цель, проблемы. Перспективы. Источники ферментов. 38. Иммобилизованные ферменты. Преимущества, методы иммобилизации. 39. Иммобилизованные ферменты. Носители для иммобилизации, практическое использование. 40. Белковая инженерия. Направления, методы, перспективы.

Контрольные вопросы к главе 3

MAS-селекция (marker assistant selection, селекция с помощью маркеров).

Введение ДНК в клетки растений с помощью Ti- и Ri-плазмид.

A. tumefaciens вызывает образование опухолей стебля двудольных растений - так называемых корончатых галлов. Бактерии прикрепляются к клетками растения в местах повреждений. Сайтами связывания на поверхности бактерий, видимо, являются молекулы β-глюкана и О-антигенной цепи липополисахарида внешней мембраны.

Бактерии связываются с рецепторами высшего растения, состоящими из белка и пектина; лектины в данном случае не имеют значения. Бактериальные сайты связывания и рецепторы растений являются констуитивными, т.е. оба партнера обладают ими еще до момента взаимодействия. Первый шаг взаимодействия с растением - узнавание - следует рассматривать как специфическую адгезию растений. Как только бактерии прикрепились к поверхности клеток растения, они начинают образовывать целлюлозные фибриллы. Эти фибриллы можно увидеть в сканирующем электронном микроскопе уже через 90 минут после добавления бактерий к суспензии культуры клеток ткани моркови. К 10 часам инкубации фибриллы формируют сеть, покрывающую поверхность растительных клеток. Фибриллы служат более прочному закреплению бактерий на поверхности хозяина. За целлюлозные фибриллы могут зацепиться свободно плавающие клетки бактерий. Фиксируя их у поверхности растения, фибриллы увеличивают множественность заражения. В результате размножения образуются скопления бактерий на поверхности растения.

Клеточная стенка растения повреждается вследствие выделения бактериями пектолитических ферментов, что обеспечивает плотный контакт бактерий с плазмалеммой растительной клетки. Этот контакт необходим для передачи ДНК от бактерий в растительную клетку. Передача ДНК происходит без нарушения целостности мембраны растительной клетки, но требует определенного её состояния - компетентности.

Способность A. tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа "корончатого галла" коррелирует с наличием у них Ti-плазмиды. Опухолевая трансформация проявляется в гипертрофии возникающей после проникновения агробактерий в пораненные участки (сайты) растений (рис. 13). Трансформация является результатом стабильного ковалентного включения (инсерции или интеграции) сегмента («transferred» или Т-ДНК) большой плазмиды (pTi - tumor inducing или pRi - root inducing) бактерий в ядерную ДНК растительной клетки.

Рисунок 10. - Генетическая колонизация растения A. tumefaciens: 1- агробактерии существуют в ризосфере; 2 - строение A. tumefaciens; 3 – встраивание Т-ДНК в геном; 4 – образование опухоли

Другой вид агробактерий – A. rhizogenes, - вызывает заболевание, именуемое "бородатый корень", при котором в зоне повреждения корня образуется масса новых корешков. A. rubi обычно индуцируют неорганизованные опухоли (тератомы), штаммы A. radiobacter авирулентны.

В отличие от большинства тканей взятых из нормальных растений, трансформированные ткани в культуре in vitro в асептических (стерильных) условиях способны неограниченно расти в отсутствие экзогенно добавленных ауксинов и цитокининов. Кроме того, трансформированные ткани часто синтезируют одну или более групп соединений, названных опинами, которые обычно не обнаруживаются в нетрансформированных растительных тканях. Наиболее подробно изучены опухоли - корончатые галлы, индуцируемые Agrobacterium tumefaciens. Они представляют собой истинно злокачественные опухоли, которые могут расти в культуральной среде в отсутствие стимуляторов роста - фитогормонов, необходимых для роста нормальных тканей.

Опухоли можно поддерживать в течение многих лет in vitro, и при их использовании они способны вызывать опухоли у здоровых растений. В природных условиях корончатые галлы образуются в месте соединения корня со стеблем (у корневой шейки), откуда и произошло их название корончатый галл. Однако корончатые галлы могут развиваться и на подземных частях растения, например на корнях плодовых деревьев, и на надземных, например на стебле винограда.

В лаборатории эти заболевания можно вызвать у здоровых растений экспериментально, путем инфицирования их бактериями. Растения перед инокуляцией должны быть поранены, при этом опухоли возникают в поврежденных сайтах растения, обычно на стебле или листьях растения. Кроме целых растений в качестве тест-объектов используются экспланты, например ломтики моркови и кусочки других органов растений.

Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксина и цитокининов. Выявлено еще одно наследуемое изменение в клетках корончатых галлов - это синтез опинов. Необычное для растений соединение, производное аргинина, обнаруженное лишь в определенных опухолевых линиях, было названо октопином. Затем было показано, что другими опухолевыми линиями синтезируется еще одно соединение - нопалин, также производное аргинина. В зависимости от типа индуцируемого в опухоли опина штаммы A. tumefaciens и находящиеся в них Ti-плазмиды получили соответствующее обозначение - октопиновые или нопалиновые.

Агробактерии, индуцирующие опухоли, в которых не обнаруживается ни нопалин, ни октопин, ранее обозначались как штаммы нулевого типа. Позднее было показано, что в опухолях нулевого типа синтезируются опины третьего класса - агропины. Обнаружены также и другие типы опинов. Поскольку все опины обнаруживаются только в опухолевых клетках и отсутствуют в клетках нормальных растений или клетках растительных опухолей других типов, то опины могут рассматриваться как специфические биохимические маркеры для клеток корончатых галлов.

Опухоли, развивающиеся из одной или нескольких клеток, быстро разрастаются в крупные образования, диаметр которых на определенных видах деревьев может достигать одного метра. Типичная неорганизованная опухоль представляет собой более или менее округлую дедифференцированную массу клеток (каллус), которая может иметь гладкую или шероховатую поверхность, быть паренхиматозной или одревесневшей. Иногда на периферии таких опухолей формируются листовидные структуры (тератомы), иногда - придаточные корни. Нередко на зараженных растениях наблюдаются вторичные опухоли, значительно удаленные от первичных. Обычно они обнаруживаются выше первичной опухоли, что предполагает движение бактерий или трансформирующего агента в направлении транспирации.

Распространение Agrobacterium и других фитопатогенных бактерий по межклетникам и ксилеме является хорошо доказанным фактом. Агробактерии могут передвигаться на большие дистанции со значительной скоростью. Очевидно, это не является единственной причиной индукции вторичных опухолей. Организацию опухолей, а именно форму, величину и характер развития, определяют три фактора:

Штамм агробактерий,

Генотип растения-хозяина,

Физиологическое состояние инфицируемых растительных клеток.

Agrobacterium имеет очень широкий круг растений-хозяев и может инфицировать практически все двудольные растения. Долгое время считалось, что однодольные растения не чувствительны к агробактериальной инфекции. В настоящее время показано, что при соблюдении определенных условий агробактерии могут инфицировать однодольные растения, в частности представителей таких семейств, как Amaryllidaceae, Liliaceae, Gramineae, Iridaceae и некоторых других. Однако существуют определенные вариации круга хозяев для различных штаммов Agrobacterium: некоторые штаммы способны вызывать галлообразование на отдельных видах растений, но не инфицируют другие. Различные сорта одного и того же растения также могут иметь различную чувствительность к данному бактериальному штамму.

Невозможность заражения в природе обуславливается отсутствием соответствующих рецепторов, необходимых для взаимодействия с бактериями. Другим фактором, препятствующим инфицированию однодольных агробактериями, возможно, является отсутствие в клетках растений низкомолекулярных индукторов вирулентности Agrobacterium, например ацетосирингона, которые обычно присутствуют в клеточном соке при поранении двудольных растений.

Подробная информация о структуре плазмид Agrobacterium получена путем их рестрикционного или физического картирования. В результате исследований обнаружено четыре основных области гомологии между октопиновой и нопалиновой плазмидами. Две консервативные (области А и D) вовлечены в онкогенность, еще одна (В) соответствует области контроля репликации плазмиды, в то время как последняя (С) кодирует функции конъюгативного переноса (рис. 14).

Таким образом, кроме Т-ДНК в плазмидах имеются область, кодирующая функцию конъюгации (Tra), область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir). Последовательности Ti-плазмиды, фланкирующие Т-ДНК (пограничные или концевые области), играют важную роль в интеграции в растительный геном и содержат несовершенные прямые повторы по 24-25 п. н. Делеция левой границы Т-ДНК не влияет на опухолеобразование, но удаление правой пограничной области приводит практически к полной утрате вирулентности. Показано, что делеция правого повтора или его части приводит к потере способности Т-ДНК включаться в растительную ДНК. Учитывая важную роль концов Т-области в переносе Т-ДНК, можно предположить, что любой сегмент ДНК, встроенный между этими концами, может быть перенесен в растения как часть Т-ДНК. Плазмиды модифицируют таким образом, чтобы удалить все онкогенные последовательности, так как они не принимают участие ни в переносе, ни в интеграции в геном клетки-хозяина. На место этих генов можно встроить чужеродную ДНК, а плазмида теряет свои онкогенные свойства. Неонкогенные Т-ДНК, присутствующие в растениях - регенерантах, передаются согласно законам Менделя. Разработаны два метода для введения Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение.

Рисунок 11. - Структура Тi-плазмид нопалинового и октопинового типа

Первый метод - метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) - основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322 (рис. 15). Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду.

Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.

Рисунок 12. - Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды: Рр - расщепление рестриктазой

Второй метод основан на создании системы бинарных (двойных) векторов.

Последние исследования показали, что для заражения и трансформации не нужна целая Ti-плазмида, а достаточны только пограничные области Т-ДНК и один участок Ti-плазмиды, ответственный за вирулентность. Причем эти два участка ДНК не обязательно должны находиться в одной и той же плазмиде. Если клетки агробактерий содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. При этом Т-ДНК с любыми встроенными в нее генами интегрирует с геномом растения, для этого не нужна гомологичная рекомбинация в бактериальных клетках. Для осуществления экспрессии чужеродных генов, нужен специфический промотор из Т-ДНК, например, промотор нопалинсинтетазы.

Показано, что он функционирует в клетках растений и может быть легко соединен с кодирующей последовательностью чужеродного гена в широко распространенных субклонах Ti-плазмид. Другое преимущество данного промотора заключается в том, что он функционирует в каллусах и в большинстве органов растений. Эффективность трансформации с помощью модифицированной Т-ДНК агробактерий превосходит на сегодняшний день все другие способы переноса генов в растение.

О механизмах, с помощью которых агробактерия переносит Т-ДНК ядра растений, известно очень мало: Т-сегменты ДНК октопиновых и нопалиновых плазмид встраиваются в разные, по-видимому случайные, точки хромосом хозяина, но при этом они никогда не интегрируют с ДНК митохондрий и хлоропластов.

Для введения сконструированных Ti-плазмид в растительную клетку может быть использовано несколько методов. Наиболее простой из них природный способ - это инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные (пораненные) области растения.

Другой метод состоит в трансформации протопластов путем кокультивирования их с агробактериями Методика кокультивации может рассматриваться как индукция опухолей в искусственных условиях: вирулентные агробактерии временно совместно культивируются с протопластами. Если агробактерии добавляются к свежевыделенным или однодневным протопластам, не наблюдается ни присоединения бактерий, ни трансформации. Существенным условием для трансформации является наличие вновь образуемых клеточных стенок у 3-дневных протопластов. Это подтверждается применением ингибиторов образования клеточной стенки, которые ингибируют и присоединение бактерий. После периода кокультивации (более суток), в течение которого наступает агрегация протопластов с бактериями, свободные бактерии удаляются повторным отмыванием. Далее растительные клетки культивируются на среде с добавлением гормонов, а через 3-4 недели небольшие колонии высеваются на безгормональную среду. На этой среде выживают только колонии трансформированных клеток.

Так были получены трансформированные растения-регенеранты табака и петунии. Этот метод дает возможность существенно расширить круг хозяев агробактерий, включая виды семейства злаковых. Эффективность кокультивирования может быть повышена применением индукторов слияния клеток (ПЭГ, кальций и др.).

Трансформация протопластов может быть проведена также кокультивированием их непосредственно с Ti-плазмидами, такие опыты были проведены с протопластами петунии, табака. Очень низкая эффективность включения Т-ДНК в протопласты, наблюдавшаяся в первых экспериментах, была затем увеличена благодаря химической стимуляции (ПЭГ). Из трансформированных клеток были получены трансгенные растения. Преимуществом этого метода является то, что отпадает необходимость в промежуточных векторах. Достижения генной инженерии растений

Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgen", а также гербицид-устойчивая соя компании "Monsanto". Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

В астоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более ста миллиардов долларов. В 1999 г. трансгенные растения были высажены на общей площади порядка 40 млн. га, что превышает размеры такой страны, как Великобритания. В США генетически модифицированные растения (GM Crops) составляют сейчас около 50% посевов кукурузы и сои и более 30-40% посевов хлопчатника. Это говорит о том, что генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки. В ближайшие годы ожидается дальнейшее быстрое увеличение площадей, занятых трансгенными формами культурных растений.

Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Улучшение качества запасных белков

Запасные белки основных культурных видов кодируются семейством близкородственных генов. Накопление запасных белков семян – сложный биосинтетический процесс. Первая генноинженерная попытка улучшения свойства одного растения путем введения гена запасного белка от другого была, проведена Д. Кемпом и Т. Холлом в 1983 г. в США. Ген фазеолина бобов с помощью Ti-плазмиды был перенесен в геном подсолнечника. Результатом этого опыта было лишь химерное растение, получившее название санбин. В клетках подсолнечника были обнаружены иммунологически родственные фазеолиновые полипептиды, что подтверждало факт переноса гена между растениями, относящимися к различным семействам

Позднее ген фазеолина был передан клеткам табака: в растениях-регенерантах ген экспрессировался во всех тканях, хотя и в малых количествах. Неспецифическая экспрессия фазеолинового гена, так же как и в случае переноса его в клетки подсолнечника, сильно отличается от экспрессии этого гена в зрелых семядолях бобов где фазеолин составлял 25-50% от общего белка. Этот факт указывает на необходимость сохранения и других регуляторных сигналов этого гена при конструировании химерных растений и на важность контроля экспрессии генов в процессе онтогенеза растений.

Ген, кодирующий запасной белок кукурузы – зеин, после интеграции его в Т-ДНК был перенесен в геном подсолнечника следующим образом. Штаммы агробактерий, содержащие Ti-плазмиды с геном зеина, использовали для индукции опухолей в стеблях подсолнечника. Некоторые из полученных опухолей содержали мРНК, синтезируемые с генов кукурузы, что дает основание рассматривать эти результаты как первое доказательство транскрипции гена однодольного растения в двудольном. Однако присутствие зеинового белка в тканях подсолнечника не обнаружилось.

Более реальной задачей для генетической инженерии считается улучшение аминокислотного состава белков. Как известно, в запасном белке большинства злаковых наблюдается дефицит лизина, треонина, триптофана, у бобовых - метионина и цистеина. Введение в эти белки дополнительных количеств дефицитных аминокислот могло бы ликвидировать аминокислотный дисбаланс. Методами традиционной селекции удалось существенно повысить содержание лизина в запасных белках злаковых. Во всех этих случаях часть проламинов (спирторастворимые запасные белки злаковых) заменялась другими белками, содержащими много лизина. Однако у таких растении уменьшались размеры зерна и снижалась урожайность. По-видимому, проламины необходимы для формирования нормального зерна, и их замена другими белками отрицательно влияет на урожайность. Учитывая это обстоятельство, для улучшения качества запасного белка зерновых нужен такой белок, который не только отличался бы высоким содержанием лизина и треонина, но и мог полноценно заменить определенную часть проламинов при формировании зерна.

Растения могут производить и белки животного происхождения. Так, встраивание в геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus химерного гена, состоящего из части гена запасного 25-белка арабидопсиса и кодирующей части для нейропептида - энкефалина, приводило к синтезу химерного белка до 200 нг на 1 г семени. Два структурных белковых домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином, что давало возможность в дальнейшем легко изолировать чистый энкефалин.

В другом эксперименте удалось после скрещивания трансгенных растений, в одном из которых был встроен ген гамма-субъединицы, а во втором - ген каппа-субъединицы иммуноглобулина, получить у потомства экспрессию обеих цепей. В результате растение формировало антитела, составляющие до 1,3% суммарного белка листьев. Также было показано, что в растениях табака могут собираться полностью функциональные секреторные моноклональные иммуноглобулины. Секреторные иммуноглобулины обычно выделяются в ротовую полость и желудок человека и животных и служат первым барьером на пути кишечных инфекций. В упомянутой выше работе получили продукцию в растениях моноклональных антител, которые были специфичны для Streptococcus mutans - бактерий, вызывающих зубной кариес. Предполагается, что на основе таких моноклональных антител, продуцируемых трансгенными растениями, удастся создать действительно антикариесную зубную пасту. Из других белков животного происхождения, которые представляют интерес для медицины, показана продукция в растениях человеческого β-интерферона.

Разработаны также подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. Получен картофель, экспрессирующий олигомеры нетоксичной субъединицы β-токсина холеры. Эти трансгенные растения могут быть использованы для получения дешевой вакцины от холеры.

Жиры

Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты - основной компонент растительного масла. По своей структуре это углеродные цепи, которые обладают различными физико-химическими свойствами в зависимости от своей длины и степени насыщения углеродных связей. В 1995 году была закончена экспериментальная проверка и получено разрешение от федеральных властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45% 12-членной жирной кислоты - лаурата. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики.

Экспериментальная работа заключалась в том, что был клонирован ген специфической тиоэстеразы из растения Umbellularia califomica, где содержание лаурата в жире семян достигало 70%. Структурная часть гена этого фермента под контролем промотора-терминатора гена белка, специфического для ранней стадии семяобразования, была встроена в геном рапса и арабидопсиса, что и привело к увеличению содержания лаурата в масле этих растений.

Из других проектов, связанных с изменением состава жирных кислот, можно упомянуть работы, ставящие целью повышение или снижение содержания ненасыщенных жирных кислот в растительном масле. Интересными представляются эксперименты с петрозелиновой кислотой - изомером олеиновой кислоты, где двойная связь находится за шестым углеродным членом. Эта жирная кислота входит в состав масла кориандра и определяет его более высокую температуру плавления (33°С), в то время как при наличии олеиновой кислоты температура плавления составляет только 12°С. Предполагается, что после переноса генов, определяющих синтез петрозелиновой кислоты, в растения - продуценты растительного масла удастся производить диетический маргарин, содержащий ненасыщенную жирную кислоту. Кроме того, из петрозелиновой кислоты очень легко получать лаурат путем окисления озоном. Дальнейшее изучение специфики биохимического синтеза жирных кислот, по-видимому, приведет к возможности управлять этим синтезом с целью получения жирных кислот различной длины и различной степени насыщения, что позволит значительно изменить производство детергентов, косметики, кондитерских изделий, затвердителей, смазочных материалов, лекарств, полимеров, дизельного топлива и многого другого, что связано с использованием углеводородного сырья.

Полисахариды

Проводится работа по созданию трансгенных растений картофеля и других крахмалнакапливающих культур, в которых это вещество будет находиться в основном в виде амилопектина, то есть разветвленной форме крахмала, или же в основном только в виде амилозы, то есть линейных форм крахмала. Раствор амилопектина в воде более жидкий и прозрачный, чем у амилозы, которая при взаимодействии с водой образует ригидный гель. Так, например, крахмал, состоящий в основном из амилопектина, по-видимому, будет иметь спрос на рынке производителей различных питательных смесей, где сейчас в качестве наполнителя используется модифицированный крахмал. Генетической модификации могут подвергаться также геномы пластид и митохондрий. Такие системы позволяют значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

Создание гербицидоустойчивых растений

В новых, интенсивных сельскохозяйственных технологиях гербициды применяются очень широко. Это связано с тем. что на смену прежним экологически опасным гербицидам широкого спектра действия, обладающим токсичностью для млекопитающих и длительно сохраняющимся во внешней среде, приходят новые, более совершенные и безопасные соединения. Однако они обладают недостатком - подавляют рост не только сорняков, но и культурных растений Такие высокоэффективные гербициды, как, глифосат, атразины интенсивно изучаются на предмет выявления механизма толерантности к ним некоторых сорняков. Так, на полях, где широко используют атразин, довольно часто появляются атразинустойчивые биотипы у многих видов растении.

Изучение механизма устойчивости к гербицидам с целью получения методами генетической инженерии культурных растений, обладающих этим признаком, включает следующие этапы: выявление биохимических мишеней действия гербицидов в растительной клетке: отбор устойчивых к данному гербициду организмов в качестве источников генов устойчивости: клонирование этих генов: введение их в культурные растения и изучение их функционирования

Существуют четыре принципиально различных механизма, которые могут обеспечивать устойчивость к тем или иным химическим соединениям, включая гербициды: транспортный, элиминирующий, регуляционный и контактный. Транспортный механизм устойчивости заключается в невозможности проникновения гербицида в клетку. При действии элиминирующего механизма устойчивости вещества, попавшие внутрь клетки, могут разрушаться с помощью индуцируемых клеточных факторов, чаще всего деградирующих ферментов, а также подвергаться тому или иному виду модификации, образуя неактивные безвредные для клетки продукты. При регуляционной резистентности белок или фермент клетки, инактивирующийся под действием гербицида, начинает усиленно синтезироваться, ликвидируя таким образом дефицит нужного метаболита в клетке. Контактный механизм устойчивости обеспечивается изменением структуры мишени (белок или фермент), взаимодействием с которым связано повреждающее действие гербицида

Установлено, что признак гербицидоустойчивости является моногенным, то есть признак детерминируется чаще всего одним-единственным геном. Это очень облегчает возможность использования технологии рекомбинантной ДНК для передачи этого признака. Гены, кодирующие те или иные ферменты деструкции и модификации гербицидов, могут быть с успехом использованы для создания гербицидоустойчивых растении методами генетической инженерии.

Традиционные методы селекции создания сортов, устойчивых к гербицидам, очень, длительны и малорезультативны. Наиболее широко применяемый за рубежом гербицид глифосат (коммерческое название Roundup) подавляет синтез важнейших ароматических аминокислот, воздействуя на фермент 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазу (ЕПШФ-синтаза). Известные случаи устойчивости к этому гербициду связаны либо с повышением уровня синтеза этого фермента (регуляционный механизм), либо с возникновением мутантного фермента, нечувствительного к глифосфату (контактный механизм). Из устойчивых к глифосфату растений был выделен ген ЕПШФ-синтазы и поставлен под промотор вируса мозаики цветной капусты. С помощью Ti-плазмиды эта генетическая конструкция была введена в клетки петунии. При наличии одной копии гена в регенерированных из трансформированных клеток растениях синтезировалось фермента в 20 - 40 раз больше, чем в исходных растениях, но устойчивость к глифосфату увеличилась только в 10 раз.

К числу наиболее распространенных гербицидов, используемых при обработке зерновых культур, относится атразин. Он подавляет фотосинтез, связываясь с одним из белков фотосистемы II и прекращая транспорт электронов. Устойчивость к гербициду возникает в результате точечных мутаций в этом пластохинон связывающем белке (замена серина на глицин), вследствие чего он теряет способность взаимодействовать с гербицидом. В ряде случаев удалось осуществить перенос гена мутантного белка в чувствительные к атразину растения с помощью Ti-плазмиды. Интегрированный в хромосому растений ген устойчивости был снабжен сигнальной последовательностью, которая обеспечивала транспорт синтезируемого белка в хлоропласты. Химерные растения проявляли значительную устойчивость к таким концентрациям атразина, которые вызывали гибель контрольных растений с геном белка дикого типа. Некоторые растения способны инактивировать атразин путем отщепления остатка хлора ферментом глутатион-S-трансфераза. Этот же фермент инактивирует и другие родственные гербициды триазинового ряда (пропазин, симазин и др.).

Существуют растения, естественная устойчивость которых к гербицидам основана на детоксикации. Так, устойчивость растений к хлорсульфурону может быть связана с дезактивацией молекулы гербицида путем его гидроксилирования и последующего гликозилирования введенной гидроксильной группы. Создание растений, устойчивых к патогенам и вредителям Устойчивость растений к тем или иным патогенам чаще всего является сложным мультигенным признаком.

Одновременная передача нескольких локусов трудна даже методами генной инженерии, не говоря о классических методах селекции. Более простым является другой путь. Известно, что у устойчивых растений при атаке патогенов изменяется метаболизм. Накапливаются такие соединения, как Н2О2, салициловая кислота, фитоаллексины. Повышенный уровень этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами.

Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает салициловую кислоту), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген Н2О2 может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

В фитовирусологии широко известен феномен индуцированной перекрестной устойчивости растений к вирусным инфекциям. Сущность этого явления состоит в том, что заражение растения одним штаммом вируса предотвращает последующую инфекцию этих растений другим вирусным штаммом. Молекулярный механизм подавления вирусной инфекции пока неясен. Показано, что для иммунизации растений достаточно введения отдельных вирусных генов, например генов капсидных белков. Так, ген белка оболочки вируса табачной мозаики перенесли в клетки табака и получили трансгенные растения, у которых 0,1% всех белков листьев был представлен вирусным белком. Значительная часть этих растений при инфицировании вирусом не проявляла никаких симптомов заболевания. Возможно, что синтезирующийся в клетках белок оболочки вируса мешает вирусной РНК нормально функционировать и формировать полноценные вирусные частицы. Установлено, что экспрессия капсидного белка вируса табачной мозаики, вируса мозаики люцерны, вируса огуречной мозаики, Х-вируса картофеля в соответствующих трансгенных растениях (табак, томаты, картофель, огурцы, перцы) обеспечивает высокий уровень их защиты от последующей вирусной инфекции. Причем у трансформированных растений не отмечалось снижения фертильности, нежелательного изменения ростовых и физиологических характеристик исходных экземпляров и их потомства. Полагают, что индуцированная устойчивость растений к вирусам обусловлена особым антивирусным белком, очень похожим на интерферон животных. Представляется возможным методом генетической инженерии усилить экспрессию гена, кодирующего этот белок, путем его амплификации или подстановки под более сильный промотор.

Следует отметить, что использование генетической инженерии для защиты растений от различных патогенных микроорганизмов в значительной мере сдерживается недостаточностью знаний о механизмах защитных реакций растений. Для борьбы с насекомыми-вредителями в растениеводстве используются химические средства - инсектициды. Однако они оказывают вредное влияние на млекопитающих, убивают и полезных насекомых, загрязняют окружающую среду, дороги, и кроме того, насекомые довольно скоро приспосабливаются к ним. Известно более 400 видов насекомых, устойчивых к используемым инсектицидам. Поэтому все большее внимание привлекают биологические средства борьбы, обеспечивающие строгую избирательность действия и отсутствие адаптации вредителей к применяемому биопестициду.

Уже довольно давно известна бактерия Bacillus thuringiensis, продуцирующая белок, являющийся очень токсичным для многих видов насекомых, в то же время безопасный для млекопитающих. Белок (дельта-эндотоксин, CRY-белок) продуцируется различными штаммами В. thuringiensis. Взаимодействие токсина с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое. В природе найдено большое количество штаммов В. thuringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты В. thuringiensis в течение десятилетий использовали для контроля насекомых на полях. Безопасность токсина и его составных белков для человека и других млекопитающих полностью доказана. Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не поедаемые насекомыми.

Кроме видоспецифичности по действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно больше адениновых и тиминовых нуклеотидных оснований, чем растительная ДНК. Эта проблема была решена путем создания модифицированных генов, где из природного гена вырезали и добавляли те или иные фрагменты с сохранением доменов, кодирующих активные части дельта-токсина. Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку. Получены трансгенные растения табака, способные синтезировать токсин. Такие растения были нечувствительны к гусеницам Manduca sexta. Последние погибали в течение 3 суток контакта с токсинпродуцирующими растениями. Токсинообразование и обусловленная им устойчивость к насекомым передавалась по наследству как доминантный признак.

В настоящее время так называемые Bt-растения (от В. thuringiensis) хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США.

В связи с возможностями генной инженерии конструировать энтомопатогенные растения на основе токсина микробного происхождения еще больший интерес к себе вызывают токсины растительного происхождения. Фитотоксины являются ингибиторами белкового синтеза и осуществляют защитную функцию, направленную против насекомых-вредителей микроорганизмов и вирусов. Лучше всех среди них изучен рицин, синтезируемый в клещевине: его ген клонирован и установлена нуклеотидная последовательность. Однако высокая токсичность рицина для млекопитающих ограничивает генноинженерные работы с ним только техническими культурами, не используемыми в пищу человека и на корм животным. Токсин, вырабатываемый фитолаккой американской, эффективен против вирусов и безвреден для животных. Механизм его действия заключается в инактивации собственных рибосом при проникновении в клетки различного рода патогенов, в том числе фитовирусов. Пораженные клетки некротизируются, предотвращая размножение патогена и его распространение по растению. В настоящее время проводятся исследования по изучению гена этого белка и передаче его в другие растения.

Вирусные болезни широко распространены среди насекомых, поэтому для борьбы с насекомыми-вредителями можно использовать природные вирусы насекомых, препараты которых называют вирусными пестицидами. В отличие от ядохимикатов они обладают узким спектром действия, не убивают полезных насекомых, они быстро разрушаются во внешней среде и не опасны для растений и животных. Наряду с вирусами насекомых используются как биопестициды некоторые грибы, поражающие насекомых-вредителей. Применяемые сейчас биопестициды являются природными штаммами энтомопатогенных вирусов и грибов, однако не исключена возможность создания в будущем методами генетической инженерии новых эффективных биопестицидов.

Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям

Растения очень часто подвергаются воздействию различных неблагоприятных факторов окружающей среды: высокие и низкие температуры, недостаток влаги, засоление почв и загазованность среды, недостаток или, напротив, избыток некоторых минеральных веществ и т. д. Этих факторов множество, поэтому и способы защиты от них многообразны - от физиологических свойств до структурных приспособлений, позволяющих преодолевать их пагубное действие.

Устойчивость растений к тому или иному стрессовому фактору является результатом воздействия множества разных генов, поэтому говорить о полной передаче признаков толерантности от одного вида растения другому генноинженерными методами не приходится. Тем не менее у генетической инженерии имеются определенные возможности для повышения устойчивости растений. Это касается работы с отдельными генами, контролирующими метаболические ответы растений на стрессовые условия, например сверхпродукцию пролина в ответ на осмотический шок, на действие засоления, синтез особых белков в ответ на тепловой шок и т. д. Дальнейшее углубленное изучение физиологической, биохимической и генетической основы ответной реакции растения на условия среды, несомненно, позволит применять методы генетической инженерии для конструирования устойчивых растений.

Пока можно отметить лишь косвенный подход для получения морозоустойчивых растений, основанный на генноинженерных манипуляциях с Pseudomonas syringae. Этот микроорганизм, сосуществующий с растениями, способствует их повреждению ранними заморозками Механизм явления связан с тем, что клетки микроорганизма синтезируют особый белок, локализующийся во внешней мембране и являющийся центром кристаллизации льда. Известно, что формирование льда в воде зависит от веществ, могущих служить центрами образования льда. Белок, вызывающий формирование кристаллов льда в различных частях растения (листья, стебли, корни), является одним из главных факторов, ответственных за повреждение тканей растений, чувствительных к ранним заморозкам. Многочисленные эксперименты в строго контролируемых условиях показали, что стерильные растения не повреждались заморозками вплоть до -6-8° С, тогда как у растений, имеющих соответствующую микрофлору, повреждения возникали уже при температурах -1,5-2° С. Мутанты этих бактерий, потерявшие способность синтезировать белок, вызывающий формирование кристаллов льда, не повышали температуру образования льда, и растения с такой микрофлорой были устойчивы к заморозкам. Штамм таких бактерий, распыленный над клубнями картофеля, конкурировал с обычными бактериями, что приводило к повышению морозоустойчивости растений. Возможно, такие бактерии, созданные с помощью методов генной инженерии и используемые в качестве компонента внешней среды, будут служить для борьбы с заморозками.

Повышение эффективности биологической азотфиксации

Хорошо изучен фермент ответственный за восстановление молекулярного азота до аммония. - нитрогеназа. Структура нитрогеназы одинакова у всех азотфиксирующих организмов. При фиксации азота непременным физиологическим условием является защита нитрогеназы от разрушения под действием кислорода. Лучше всех среди азотфиксаторов изучены ризобии, образующие симбиоз с бобовыми растениями, и свободноживущая бактерия Klebsiella pneumoniae. Установлено, что у этих бактерий за фиксацию азота ответственно 17 генов - так называемых nif-генов. Все эти гены сцеплены друг с другом и расположены в хромосоме между генами ферментов биосинтеза гистидина и генами, определяющими усвоение шикимовой кислоты. У быстрорастущей ризобии nif-гены существуют в форме мегаплазмиды, содержащей 200-300 тысяч пар нуклеотидов.

Среди генов азотфиксации выявлены гены, контролирующие структуру нитрогеназы, белковый фактор, принимающий участие в транспорте электронов, регуляторные гены. Регуляция генов азотфиксации довольно сложна, поэтому генноинженерный перенос азотфиксирующей функции от бактерий непосредственно высшим растениям в настоящее время уже не обсуждается. Как показали эксперименты, даже в самом простом эукариотическом организме - дрожжах не удалось добиться экспрессии nif-генов, хотя они и сохранялись в течение 50 генераций.

Эти опыты показали, что диазотрофность (азот-фиксация) свойственна исключительно прокариотическим организмам, и nif-гены не смогли преодолеть барьер, разделяющий прокариоты и эукариоты, из-за слишком сложной своей структуры и регуляции генами, расположенными вне nif-области. Возможно, более удачным окажется перенос nif-генов с помощью Ti-плазмид в хлоропласты, поскольку механизмы экспрессии генов в хлоропластах и в клетках прокариот близки. В любом случае нитрогеназа должна быть защищена от ингибирующего действия кислорода. Кроме того, фиксация атмосферного азота - очень энергоемкий процесс. Вряд ли растение под влиянием nif-генов может так кардинально изменить свой метаболизм, чтобы создать все эти условия. Хотя не исключено, что в будущем методами генетической инженерии можно будет создать более экономно работающий нитрогеназный комплекс.

Более реально использование генноинженерных методов для решения следующих задач: повышение способности ризобии колонизировать бобовые растения, повышение эффективности фиксации и ассимиляции азота путем воздействия на генетический механизм, создание новых азотфиксирующих микроорганизмов путем введения в них nif-генов, передача способности к симбиозу от бобовых растений к другим.

Первостепенной задачей генетической инженерии для повышения эффективности биологической фиксации азота является создание штаммов ризобии с усиленной азотфиксацией и колонизирующей способностью. Колонизация бобовых растений ризобиями протекает очень медленно, лишь единичные из них дают начало клубенькам. Это происходит потому, что местом инвазии ризобии является только одна небольшая область между точкой роста корня и ближайшим к ней корневым волоском, находящимся на стадии формирования. Все остальные части корня и развившиеся корневые волоски растения нечувствительны к колонизации. В ряде случаев сформировавшиеся клубеньки оказываются неспособными фиксировать азот, что зависит от многих растительных генов (выявлено не менее пяти), в частности от неблагоприятного сочетания двух рецессивных генов.

Традиционными методами генетики и селекции удалось получить лабораторные штаммы ризобий с более высокой колонизирующей способностью. Но они в полевых условиях испытывают конкуренцию со стороны местных штаммов. Повышение их конкурентоспособности, видимо, можно осуществить генноинженерными методами. Повышение эффективности процесса азотфиксации возможно применением генноинженерных приемов, основанных на увеличении копий гена, усилении транскрипции тех генов, продукты которых образуют «узкое» место в каскадном механизме азотфиксации, путем введения более сильных промоторов и т. п. Важно повышение коэффициента полезного действия самой нитро-геназной системы, осуществляющей непосредственное восстановление молекулярного азота в аммиак.

Повышение эффективности фотосинтеза

С4-растения характеризуются высокими темпами роста и скоростью фотосинтеза, у них практически отсутствует видимое фотодыхание. У большинства сельскохозяйственных культур, относящихся к С3-растениям, высокая интенсивность фотодыхания. Фотосинтез и фотодыхание - тесно связанные процессы, в основе которых лежит бифункциональная активность одного и того же ключевого фермента - рибулозобисфосфат-карбоксилазы (РуБФК). РуБФ-карбоксилаза может присоединять не только С02, но и 02, то есть осуществляет реакции карбоксилирования и оксигенирования. При оксигенировании РуБФ образуется фосфогликолат, который служит основным субстратом фотодыхания - процесса выброса С02 на свету, в результате чего теряется часть фотосинтетических продуктов. Низкое фотодыхание у С4-растений объясняется не отсутствием ферментов гликолатного пути, а ограничением оксигеназной реакции, а также реассимиляцией С02 фотодыхания.

Одной из задач, стоящих перед генетической инженерией, является исследование возможности создания РуБФК с преобладающей карбоксилазной активностью.

Получение растений с новыми свойствам

В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180°. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.

Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям.

Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.

Cтратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений. Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений.

В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему "лишних косточек", например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты (явление сайлесинга – замолкания генов). Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. М. А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу. Не менее интере сен и другой аспект работ - получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров - это получение растений петунии с разноцветными цветками. На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума. Проблемы биобезопасности трансгенных растений

Одним из главных возражений против употребления "трансгенных" продуктов питания является наличие во многих из них генов устойчивости к антибиотику (в частности, к канамицину), которые содержались в исходной конструкции ДНК в качестве селективных.

Предполагается, что эти гены устойчивости могут при переваривании пищи передаваться эндогенной микрофлоре, в том числе патогенной, в результате чего микробы могут приобрести резистентность к данному антибиотику. Однако в реальности вероятность такого события ничтожно мала - многочисленные эксперименты и наблюдения в природе относительно подобного горизонтального переноса генов до сих пор давали только отрицательные результаты.

Не стоит забывать, что встраиваемые в растения гены устойчивости "настроены" для экспрессии лишь в эукариотических, но не бактериальных клетках. Надо учесть и то, что эти селективные гены взяты из природных популяций микроорганизмов, где они сейчас широко распространены в результате активного применения антибиотиков в медицинской практике. Поэтому вероятность попадания гена устойчивости к антибиотику в микрофлору человека из природного резервуара несравнимо реальнее, чем при употреблении трансгенных растений. Однако, учитывая настроения общественности, разрабатываются подходы, для исключения присутствия "подозрительных" генов в коммерциализированных трансгенных формах.

В большинстве случаев маркерные гены устойчивости к антибиотикам сейчас заменяют на гены устойчивости к гербицидам. Правда, применение "гербицидных" генов также встречает возражения, но уже защитников окружающей среды. Предложено несколько способов избирательной элиминации маркерного гена после получения желаемого трансгенного растения, когда он фактически уже не нужен.

Очень перспективным представляется замена селективных генов на репортерные при отборе трансгенных форм растений, либо использование альтернативных селективных генов, таких как гены синтеза фитогормонов или гидролиза особых форм полисахаридов при выращивании растений в культуральной среде. Таким образом, даже эта виртуальная опасность, связанная с генами устойчивости к антибиотику, в скором времени перестанет существовать.

Что касается возможной токсичности или аллергенности трансгенных растений, то здесь применяют те же жесткие стандарты, как и для полученных традиционным путем новых сортов культурных растений или новых видов продуктов питания. Никаких особых отличий трансгенных растений от обычных по этим параметрам ожидать не приходится (разве что в лучшую сторону при блокировании синтеза токсинов или аллергенов), да и действительно, как правило, не наблюдается на практике.

Проблема возможного ущерба для окружающей среды имеет несколько аспектов. Во-первых, существует опасение, что устойчивые к гербицидам культурные растения могут при межвидовом опылении передавать эти гены близкородственным сорнякам, которые могут превратиться в неистребимые суперсорняки (superweeds). Хотя вероятность такого нежелательного развития событий для большинства сельскохозяйственных культур очень мала, генные инженеры и ученые-аграрии активно разрабатывают подходы для исключения подобной опасности. Здесь, правда, надо отметить, что данный вопрос также не нов, так как в практике сельского хозяйства уже давно используется ряд устойчивых к гербицидам сортов, полученных путем обычной селекции. При этом никакой экологической катастрофы широкое использование таких устойчивых сортов до сих пор не вызвало.

Тем не менее и в этом случае, чтобы отвести любые возражения от трансгенных растений, пробуют, например, вводить в растения не один, а сразу несколько генов устойчивости к разным гербицидам. Передача нескольких генов сорнякам гораздо менее вероятна, чем одного гена. Кроме того, мультигербицидная устойчивость позволит чередовать разные гербициды при обработке посевов, что не даст возможности для распространения какого-либо определенного гена устойчивости в сорняках.

Предлагается также вводить гены устойчивости не в ядерный, а в хлоропластный геном. Это может предотвратить нежелательный дрейф генов с помощью пыльцы, так как хлоропласты наследуются только по материнской линии.

Еще один генно-инженерный путь борьбы с сорняками без использования генов резистентности к гербицидам вообще – биотрансгенный. Речь идет об использовании мелких животных, например, кроликов, для поедания сорняков на полях. При этом, чтобы оградить от поедания культурные растения, в них можно ввести какой-либо ген, делающий их непривлекательными (запах, вкус) для данного животного. Такой биотрансгенный подход сразу снял бы большинство выдвигаемых сейчас возражений против трансгенных культур.

Близкие по сути экологические возражения касаются трансгенных растений со встроенными "инсектицидными" генами, способных, как считают, спровоцировать у насекомых-вредителей возникновение массовой резистентности. Здесь также предложены действенные способы для уменьшения этой опасности, например, использование генов нескольких разных токсинов и/или индуцибельных промоторов, быстро активирующихся при нападении насекомых на растение. Данная проблема в общем не нова, так как многие из инсектицидов, используемых сейчас на "генном уровне", давно применяют в виде чистого вещества для опрыскивания посевов.

Еще одно нежелательное следствие использования трансгенных растений с генами инсектицидов заключается в том, что пыльца этих растений может быть токсичной и для полезных насекомых, которые данной пыльцой питаются. Некоторые экспериментальные данные говорят о том. что такая опасность действительно существует, хотя о ее возможных масштабах говорить пока трудно. Однако и здесь уже предложены и испытаны адекватные генно-инженерные решения, например, использование трансгеноза через хлоропластную ДНК, или промоторов, не работающих в пыльце.

Надежды, которые возлагаются на генетически модифицированные (ГМ) растения, можно подразделить на два основных направления:

1.Усовершенствование качественных характеристик продукции растениеводства.

2. Увеличение продуктивности и стабильности растениеводства путем повышения резистентности растений к неблагоприятным факторам.

Создание генетически модифицированных растений чаще всего выполняется для решения следующих конкретных задач:

1) В целях увеличения урожайности путем повышения:

а) резистентности к патогенам;

б)резистентности к гербицидам;

в) устойчивости к неблагоприятным температурам, невысокому качеству почв;

г) улучшения характеристики продуктивности (вкусовых и питательных качеств, оптимальный метаболизм).

2) В фармакологических целях:

а) получение продуцентов терапевтических агентов;

б) продуцентов антигенов, обеспечения пищевой «пассивной» иммунизации.

Основные задачи ДНК –технологии в создании ГМ – растений в современных условиях развития сельского хозяйства и общества довольно многообразны и заключаются в следующем:

1. Получение гибридов (совместимость, мужская стерильность).

2. Оптимизация роста и развития растений (изменение габитуса растений – например, высоты, формы листьев и корневой системы и др.; изменения в цветении – например, строении и окраске цветков, времени зацветания).

3. Оптимизация питания растений (фиксация атмосферного азота небобовыми растениями; улучшение поглощения элементов минерального питания; повышение эффективности фотосинтеза).

4. Улучшение качества продукции (изменение состава и/или количества жиров; изменение вкуса и запаха пищевых продуктов; получение новых видов лекарственного сырья; изменение свойств волокна для текстильного сырья; изменение качества и сроков созревания или хранения плодов).

5. Повышение устойчивости к абиотическим факторам стресса (устойчивость к засухе и засолению. Жаростойкость; устойчивость к затоплению; адаптация к холоду; устойчивость к гербицидам; устойчивость к кислотности почв и алюминию; устойчивость к тяжелым металлам).

6. Увеличение устойчивости к биотическим факторам стресса (устойчивость к вредителям4 устойчивость к бактериальным, вирусным и грибным болезням).

Среди генов, определяющих устойчивость к гербицидам, уже клонированы гены устойчивости к таким гербицидам, как глифосат (Раундап). Фосфинотрицин (Биалафос), глифосинат аммония (Баста), сульфонилмочевинные и имидозолиновые препараты. С использованием этих генов уже получены трансгенные соя, кукуруза, хлопчатник и т.д. В России также проходят испытания трансгенные культуры, устойчивые к гербицидам. В Центре «Биоинженерия» создан сорт картофеля, устойчивый к Басте, проходящий в настоящее время полевые испытания.

n Общая площадь выращивания генетически модифицированных (ГМ) трансгенных растений в 2004 г в мире составила 81 млн.га

n В основном, это ГМ, модифицированные в отношении устойчивости к патогенным агентам и гербицидам

Эти исследования способствуют развитию новых подходов в сельском хозяйстве – к диагностике болезней, идентификации генетических признаков пород и сортов для селекции животных и растений с новыми улучшенными свойствами на основе направленного изменения геномов. В современных ДНК технологиях у животных и растений можно выделить три основных направления:

1) ДНК – технологии для управления потоком генетического материала (селекция с помощью молекулярно- генетических маркеров-MAS, в этих целях – картирование, маркирование главных генов количественных признаков- QTL); сохранение биоразнообразия с использованием молекулярно- генетических маркеров; разработка генетически обоснованных программ разведения и подбора родительских форм организмов с учетом данных экологической генетики.

2) ДНК технологии для создания новых форм организмов в целях получения «биореакторов» (продуцентов терапевтически важных для человека белков), изучения генетических механизмов развития и предупреждения различных заболеваний, а также для фундаментальных исследований структурно- функциональной организации генетического материала, межгенных взаимодействий.

3) Днк технологии для направленного получения и размножения желательных генотипов – использование стволовых эмбриональных клеточных линий, направленная модификация определенных генов, получение однояйцевых близнецов и др.

ДНК экология. Ряд экологических и агроэкологических проблем в решении которых большие надежды возлагаются на ДНК технологии, носит комплексный характер. К ним относится проблема повышения плодородия почв. Использование для этих целей удобрений, главным образом, азотистых, не дает желаемого эффекта по двум причинам. Во-первых, химический синтез азотистых удобрений идет с помощью энергоёмкого и дорогостоящего процесса. Во-вторых, для создания в почве нужной концентрации удобрений их вносят в избытке и они в значительном количестве вымываются, что приводит к загрязнению водоёмов и к нежелательным экологическим сдвигам в окружающей среде. В связи с этим ДНК технологиям предстоит разработать способы использования биологической системы фиксации азота для обеспечения солями аммония сельскохозяйственных культур. Возможны несколько вариантов решения этой задачи: применение свободно живущих бактерий, фиксирующих азот, или изолированной модифицированной нитрогеназы (фермент, ведущий биологическую азотфиксацию) в промышленном производстве аммиака; повышение эффективности природных азотфиксирующих бактерий- симбионтов и разработка новых симбиотических ассоциаций; введение генов азотфиксации (nif-генов) в культурные растения.. и др.

1. Перспекивые развития генной инженерии.

2. Что такое рекомбинантные молекулы ДНК?

3. Что такое генетическая трансформация растении?

4. Перечислите основные методы генетической инженерии растений.

5. Охарактеризуйте пути повышения биологической фиксации атмосферного азота.

Литература:

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1 - 3. М.: Мир, 1994.

2. Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. 246 с.

3. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦиГСО РАН, 1993. – 241 с.

4. Барановов В. С. Генная терапия – медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал. № 3. 1999. С. 3 – 68.

5. Бекер М. Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 334 с.

6. Борисюк Н.В. Молекулярно - генетическая конституция соматических гибридов // Биотехнология. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. М., 1988. Т. 9. С. 73 -113.

7. Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.

8. Глеба Ю. Ю. Биотехнология растений // Соросовский образовательный журнал. № 6. 1998. С. 3 – 8.

9. Глебов О. К. Генетическая трансформация соматических клеток // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988.

10. Гольдман И. Л., Разин С. В., Эрнст Л. К., Кадулин С. Г., Гращук М. А. Молекулярно-биологические аспекты проблемы позиционно-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгенных животных // Биотехнология. 1994. № 2.

11. Дыбан А. П., Городецкий С. И. Интродукция в геном млекопитающих чужеродных генов: пути и перспективы // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.: Наука, 1986. С. 82 - 97.

12. Егоров Н. С., Самуилов В. Д. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // Биотехнология. Кн. 2. М.: Высшая школа, 1988. 208 с.

13. Зверева С. Д., Романов Г. А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: хара¬ктеристика и методы тестирования // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 479-488.

14. Лещинская И. Б. Генетическая инженерия // Соросовский образовательный журнал. 1996. №1. С. 33 - 39.

15. Ли А., Тинланд Б. Интеграция т-ДНК в геном растений: прототип и реальность // Физиология растений. 2000, том 47, № 3. С. 354-359

16. Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н. и др. Генетика развития растений. СПб.: Наука, 200. 539 с.

17. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.

18. Пирузян Э. С., Андрианов В. М. Плазмиды агробактерий и генная инженерия растений.М.: Наука, 1985. 280 с.

19. Пирузян Э. С. Генетическая инженерия растений.М.: Знание, 1988. 64 с.

20. Пирузян Э. С. Основы генетической инженерии растений.М.: Наука, 1988. 304 с.

21. Пирузян Э. С. Проблемы экспрессии чужеродных генов в растениях // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Биотехнология. 1990. Т. 23. 176 с.

22. Попов Л. С., Языков А. А. Трансгенные животные как модели для изучения репродукции эмбрионального развития и заболеваний человека // Успехи современной биологии.1999. Т 119, № 1. С. 30-41.

Технология белковой инженерии используется (часто - в сочетании с методом рекомбинантных ДНК) для улучшения свойств существующих белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создания новых, не существующих в природе протеинов. Такие белки применяются для создания лекарственных препаратов, при обработке пищевых продуктов и в промышленном производстве .

В настоящее время наиболее популярной областью применения белковой инженерии является изменение каталитических свойств ферментов для разработки «экологически дружественных» промышленных процессов. С точки зрения охраны окружающей среды ферменты являются наиболее приемлемыми из всех катализаторов, используемых в промышленности. Это обеспечивается способностью биокатализаторов растворяться в воде и полноценно функционировать в среде с нейтральным рН и при сравнительно низких температурах. Кроме того, благодаря их высокой специфичности, в результате применения биокатализаторов образуется совсем немного нежелательных побочных продуктов производства. Экологически чистые и энергосберегающие промышленные процессы, использующие биокатализаторы, уже давно активно внедряются химической, текстильной, фармацевтической, целлюлозно-бумажной, пищевой, энергетической и других областях современной промышленности.

Однако некоторые характеристики биокатализаторов делают их использование в ряде случаев неприемлемым. Например, большинство ферментов распадается при повышении температуры. Ученые пытаются преодолеть подобные препятствия и увеличить стабильность ферментов в суровых условиях производства с помощью методов белковой инженерии .

Кроме промышленного применения, белковая инженерия нашла себе достойное место и в медицинских разработках. Исследователи синтезируют белки, способные связываться с вирусами и мутантными генами, вызывающими опухоли, и обезвреживать их; создают высокоэффективные вакцины и изучают белки-рецепторы клеточной поверхности, которые часто являются мишенями для фармацевтических препаратов. Ученые, занимающиеся усовершенствованием продуктов питания, используют белковую инженерию для улучшения качеств белков, обеспечивающих сохранность продуктов растительного происхождения, а также желирующих веществ или загустителей.

Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей .

Библиотеки пептидов и эпитопов

В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция транскрипции генов под действием различных белковых факторов, взаимодействие белковых лигандов с рецепторами на поверхности клеток, а также специфическое связывание антигенов соответствующими антителами. Понимание молекулярных механизмов взаимодействия белковых лигандов с рецепторами имеет большое фундаментальное и прикладное значение. В частности, разработка новых лекарственных препаратов белковой природы обычно начинается с идентификации исходной последовательности аминокислот, обладающей требуемой биологической активностью (так называемая "основная" (lead) последовательность). Однако пептиды с основной последовательностью аминокислот могут обладать и нежелательными биологическими свойствами: низкой активностью, токсичностью, малой стабильностью в организме и т.п.

До появления библиотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию библиотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления среди них пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие библиотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например антителам .

По способам получения библиотеки пептидов разделяются на три группы. К первой группе можно отнести библиотеки, полученные с использованием химического синтеза пептидов, в которых индивидуальные пептиды иммобилизованы на микроносителях. При таком подходе после присоединения очередных аминокислот в индивидуальных реакционных смесях к пептидам, иммобилизованным на микроносителях, содержимое всех реакционных смесей объединяют и разделяют на новые порции, которые используют на следующей стадии присоединения новых аминокислотных остатков. После проведения ряда таких этапов оказываются синтезированными пептиды, содержащие последовательности использованных в синтезе аминокислот во всевозможных случайных сочетаниях.

Библиотеки пептидов, иммобилизованных на микроносителях, обладают существенным недостатком: они требуют при скрининге использования очищенных рецепторов, находящихся в растворимой форме. В то же время в большинстве случаев при биологических испытаниях, проводящихся для фундаментальных и фармакологических исследований, чаще всего находят применение рецепторы, ассоциированные с мембранами. По второму способу библиотеки пептидов получают с помощью твердофазного синтеза пептидов, при котором на каждой стадии химического присоединения очередной аминокислоты к растущим пептидным цепям используют эквимолярные смеси всех или некоторых аминокислот-предшественников. На конечной стадии синтеза проводят отделение пептидов от носителя, т.е. перевод их в растворимую форму. Третий подход к конструированию библиотек пептидов, к описанию которого мы сейчас переходим, стал реальным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Он прекрасно иллюстрирует возможности таких методов и, несомненно, является крупным достижением в их применении. В этой связи рассмотрим более подробно результаты использования библиотек пептидов в исследовании эпитопов (антигенных детерминант) белков .

Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, библиотеки пептидов, полученные генно-инженерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Два недавно сделанных наблюдения позволяют рассматривать библиотеку пептидов одновременно и в качестве библиотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образуемые между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд-рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую библиотеку пептидов - как библиотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов.

Библиотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению методами генной инженерии в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. (Данный метод известен под названием фагового дисплея.) В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на N- или С-концах которых присутствуют дополнительные последовательности аминокислот.

Библиотеки пептидов и эпитопов найдут свое применение и в исследованиях механизмов гуморального иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы. В частности, большинство аутоиммунных заболеваний сопровождается образованием аутоантител против антигенов собственного организма. Эти антитела во многих случаях служат специфическими маркерами того или иного аутоиммунного заболевания. С использованием библиотеки эпитопов, в принципе, можно получить пептидные маркеры, с помощью которых было бы возможно следить за специфичностью аутоантител во время развития патологического процесса как в индивидуальном организме, так и в группе пациентов и, кроме того, определять специфичность аутоантител при заболеваниях неизвестной этиологии.

Библиотеки пептидов и эпитопов потенциально могут быть использованы также для скрининга иммунных сывороток с целью выявления пептидов, специфически взаимодействующих с защитными антителами. Такие пептиды будут имитировать антигенные детерминанты патогенных организмов и служить мишенями для защитных антител организма. Это позволит использовать подобные пептиды для вакцинации пациентов, у которых отсутствуют антитела против соответствующих патогенов. Изучение эпитопов с помощью библиотек пептидов является частным случаем одного из многочисленных направлений их использования в прикладных и фундаментальных исследованиях взаимодействия лигандов и рецепторов. Дальнейшее усовершенствование этого подхода должно способствовать созданию новых лекарственных препаратов на основе коротких пептидов и быть полезным в фундаментальных исследованиях механизмов белок-белковых взаимодействий .

-- [ Страница 1 ] --

Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего

профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии»

Комплект 2

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

НОУДПО «Институт «АйТи»

Учебно-методическое пособие. Часть 1: Тексты лекций

Учебно-методическое пособие. Часть 2: Методические рекомендации по изучению дисциплины

Учебно-методические материалы для практических занятий, семинаров, лабораторных работ и деловых игр

Дидактические материалы для работы профессорско-преподавательского состава. Учебные видео- и аудиоматериалы, слайды, эскизы плакатов.

Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии»

Комплект Раздел 4. Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки «Нанотехнология»

с профилем подготовки «Нанобиотехнологии»

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ МАГИСТРОВ ПО ДИСЦИПЛИНЕ

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

ЧАСТЬ 1: ТЕКСТЫ ЛЕКЦИЙ

НОУДПО «Институт «АйТи» Введение

1. Предмет и задачи белковой инженерии

2. Постановка задачи и проведение эксперимента в белковой инженерии

3. Генно-инженерные методы белковой инженерии

Бесклеточная система экспрессии.

5. Экспрессия генов и препаративное получение целевых белков в практической белковой инженерии

6. Ренатурация генно-инженерных белков

Введение биологической активности в искусственные белки

8. Элиминирование отдельной биологической активности в рекомбинантных белках

Литература

УДК 577. ББК 28.

ВВЕДЕНИЕ

Задача дисциплины "Белковая инженерия"- обучить студентов базовым знаниям по предмету, которые включают в себя как основные теоретические представления, так и практические приемы работы с генами и рекомбинантыми белками, их направленному изменению и исследованию. В программу курса входят такие направления, как генноинженерные основы белковой инженерии (клонирование и экспрессия генов, полимеразная цепная реакция, мутагенез), основные методы получения рекомбинантных белков в различных экспрессирующих системах, выделение и очистка белков (включая ренатурацию), основные методы исследования рекомбинантных белков.

К урс должен подготовить студентов к выполнению работ практикума по белковой инженерии, курсовых и дипломных проектов, связанных с получением и исследование рекомбинантных белков. Разделы курса охватывают такие темы, как предмет и задачи белковой инженерии, генно-инженерные методы белковой инженерии, постановка задачи и проведение эксперимента, системы экспрессии генов и их использование в практической белковой инженерии, оптимизация экспрессии и препаративное получение белков в белковой инженерии, ренатурация и очистка генно-инженерных белков. На конкретных примерах работы кафедры биоинженерии рассматриваются такие задачи, как получение искусственных белков с заданной структурой и свойствами и введение/элиминирование заданных биологических активностей. В целом, дисциплина "Белковая инженерия" представляет собой часть учебной подготовки магистров по профилю "Нанобиотехнологии", она посвящена работе с одним из важнейших биологических нанообъектов – белками и тесно связана с другими дисциплинами курса.

Белковая инженерия - направление молекулярной биологии и биоинженерии, целью которого является целенаправленное изменение структуры природных белков и получение новых белков с заданными свойствами. Белки – это важнейший биологический объект, без которого невозможно существование жизни, поэтому инженерия белков является неотемлемой составной частью инженерии биологических наноструктур. Природные белки приспособлены для функционирования в живых организмах, однако они зачастую не подходят для применения в биотехнологии и медицине в нативном виде – необходима их «оптимизация» для нужд человека. Именно такая оптимизация составляет задачу белковой инженерии.

Белковая инженерия возникла в начале 80-х годов 20 века, когда были разработаны основные методы генетической инженерии, позволившие получать различные природные белки с помощью бактерий или дрожжей, а также определенным образом изменять структуру генов и, соответственно, аминокислотную последовательность кодируемых ими белков. Необходимым условием появления белковой инженерии было развитие методов химического синтеза олигонуклеотидов, позволившее создавать искусственные фрагменты генов и целые гены, а также развитие теоретических методов предсказания и анализа структуры белков и физических методов их исследования. Исходя из принципов организации белковых молекул, взаимосвязи структуры и функции белков, белковая инженерия создат научно обоснованную технологию направленного изменения их структуры. С помощью белковой инженерии удатся повышать термостабильность белков, их устойчивость к денатурирующим воздействиям, органическим растворителям, изменять лиганд-связывающие свойства. Белковая инженерия позволяет путм замены аминокислот улучшать работу ферментов и их специфичность, изменять оптимальные значения рН, при которых работает фермент, исключать нежелательные побочные активности, устранять участки молекул, ингибирующие ферментативные реакции, повышать эффективность белковых лекарственных препаратов и т.д. Например, замена лишь одного остатка треонина на пролин позволила в 50 раз повысить активность фермента тирозил-тРНК-синтетазы, а благодаря замене 8 аминокислотных остатков термолизин-подобная протеаза из Bacillus stearothermophilus приобрела способность сохранять активность при 1000С в течение нескольких часов. К белковой инженерии можно отнести также работы по направленному изменению свойств белков с помощью химических модификаций, например, введение фотоактивируемых соединений, изменяющих свойства молекулы под действием света, соединений-меток, позволяющих отслеживать пути перемещения белка в клетке или направлять его к различным компонентам клетки и т.д. Такие работы проводятся преимущественно на рекомбинантных белках, получаемых с помощью генно-инженерных методов.

В современной белковой инженерии можно выделить два направления:

рациональный дизайн и направленная молекулярная эволюция белков. Первое подразумевает использование информации о структурно-функциональных отношениях в белках, получаемой с помощью физико-химических и биологических методов, а также компьютерного молекулярного моделирования, для того, чтобы определить, какие именно изменения в первичной структуре должны привести к желаемому результату. Так, для повышения термостабильности белка необходимо определить его пространственную структуру и выявить "слабые" участки, например, аминокислоты, недостаточно сильно связанные со своим окружением. Затем подобрать для них наилучшие варианты замен на другие аминокислоты с помощью молекулярного моделирования и оптимизации энергетических параметров молекулы, После этого нужно подвергнуть мутации соответствующий ген, а затем получить и исследовать мутантный белок. Если этот белок не удовлетворяет заданным параметрам, проводят новый анализ и повторяют описанный цикл.

Это направление наиболее адекватно выражено в случае конструирования искусственных белков (белков de novo) с заданными свойствами, когда на входе имеется новая аминокислотная последовательность белка, в основном или полностью заданная человеком, а на выходе – белковая молекула с желаемыми характеристиками. Пока, однако, таким образом удатся получать только небольшие белки de novo с несложной пространственной структурой и вводить в них простые функциональные активности, например, металлсвязывающие участки или короткие пептидные фрагменты, несущие какие-либо биологические функции.

При направленной молекулярной эволюции белков с помощью генно-инженерных методов получают большой набор различных мутантных генов целевого белка, которые затем экспрессируют специальным образом, например, на поверхности фагов ("фаговый дисплей") или в бактериальных клетках, с тем, чтобы сделать возможным отбор мутантов с лучшими характеристиками. С этой целью, например, гены нужного белка или его частей встраиваются в геном фага в состав гена, кодирующего белок, расположенный на поверхности фаговой частицы. При этом каждый индивидуальный фаг нест свой мутантный белок, обладающий определенными свойствами, по которым делается отбор. Мутантные гены получают путм "перемешивания" набора генов сходных природных белков различных организмов, как правило, с помощью метода полимеразной цепной реакции, так что каждый получаемый мутантный белок может включать в себя фрагменты многих "родительских" белков. По сути, этот подход имитирует природную эволюцию белков, но только существенно более быстрыми темпами. Основная задача белкового инженера в данном случае заключается в разработке эффективной селектирующей системы, которая позволит отбирать лучшие мутантные варианты белков с нужными параметрами. В случае вышеупомянутой задачи – повысить термостабильность белка, отбор можно вести, например, путм выращивания клеток, содержащих мутантные гены, при повышенной температуре (при условии, что присутствие в клетке мутантного белка увеличивает е температурную устойчивость).

Оба названных направления белковой инженерии имеют одну цель и дополняют друг друга. Так, исследование получаемых с помощью методов молекулярной эволюции мутантных вариантов белков позволяет лучше понять структурно-функциональную организацию белковых молекул и использовать полученные знания для целенаправленного рационального дизайна новых белков. Дальнейшее развитие белковой инженерии дат возможность решать многие практические задачи по улучшению природных и получению новых белков для нужд медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. В будущем возможно создание белков, обладающих функциями, неизвестными в живой природе.

Настоящий курс белковой инженерии включает в себя как основные теоретические представления, так и практические приемы работы с генами и рекомбинантыми белками, их направленному изменению и исследованию. Этот курс находится в неразрывной связи с другими дисциплинами программы подготовки магистров, прежде всего, с дисциплиной "Молекулярная биоинженерия", частью которой, фактически, является. Белковая инженерия и рациональный дизайн белков обязательно включают в себя элементы компьютерного моделирования, поэтому они связаны с дисциплиной "Молекулярное моделирование нано-и биоструктур" и более общей дисциплиной "Компьютерные технологии в науке и образовании". Изучение свойств получаемых с помощью белковой инженерии рекомбинантных белков требует применения современных методов их исследования, таких как конфокальная и атомно-силовая микроскопия, компьютерная томография, электронная микроскопия, поэтому белковая инженерия связана с соответствующими дисциплинами, посвященными данным методам. Объектом белковой инженерии являются белковые наноструктуры, поэтому очевидна ее связь с дисциплиной "Основы нано- и биобезопасности". Таким образом, дисциплина "Белковая инженерия" представляет собой неотемлемую часть подготовки магистров по профилю "Нанобиотехнологии" направления "Нанотехнологии".

Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Дать определение термина "Белковая инженерия" 2. Чем белковая инженерия отличается от других видов инженерии?

3. Каковы предпосылки появления белковой инженерии?

4. Какие задачи может решать белковая инженерия?

5. Какие направления белковой инженерии Вы знаете?

6. Что такое направленная молекулярная эволюция белков?

7. Как белковая инженерия связана с другими разделами нанобиотехнологии?

2. Постановка задачи и проведение эксперимента в белковой инженерии Белки представляют собой важнейший компонент живых организмов, они выполняют целый ряд функций: каталитические, регуляторные, структурные, транспортные и другие. Белки состоят из последовательно соединенных аминокислотных остатков (первичная структура белка), образующих, как правило, регулярные элементы - вторичную структуру, в которой аминокислотные остатки соединены между собой водородными связями,. Основными элементами вторичной структуры белка являются альфа-спираль и бета-структура, исследователи выделяют также и другие, менее распространенные регулярные элементы – спираль 310, пи-спираль, бета-изгибы и другие элементы, о которых вы можете узнать в курсе физики белка (А.В.Финкельштейн, О.Б.Птицын, Физика белка).

Часть аминокислотных остатков белка, порой весьма существенная часть, имеет неупорядоченную структуру, которую называют еще клубкообразной. Можно условно выделить три класса белков: глобулярные, фибриллярные и мембранные, и все три эти класса являются объектом для белковой инженерии.

На первом рисунке показана иерархия структур белковой молекулы. В альфаспиральной структуре водородные связи соединяют остатки i и i+3 и, таким образом, образуется геометрия спирали. В бета-структуре соединены водородными связями расположенные рядом линейные участки аминокислотной последовательности (участок с показанными пунктиром водородными связями справа от выделенной синим цветом альфаспирали на рисунке 1). Альфа-, бета- и другие структуры, будучи уложены определенным образом, формируют пространственную или третичную структуру белка. И, наконец, белки могут быть соединены друг с другом в четвертичную структуру – клубок белков (отметим, однако, что это вовсе не хаотичный, а высоко упорядоченный клубок, где каждому белку отводится свое место).

Что же может белковая инженерия и какие свойства белков изменяют белковые инженеры? Современная белковая инженерия может многое. В частности, для ферментов она позволяет следующее (Таблица):

увеличивать Vmax, то есть максимальную скорость ферментативной реакции, уменьшать константу Михаэлиса Km, измененять оптимальные значения рН, при которых работает фермент;

устранять «плохие» остатки и участки белка, ингибирующие ферментативную реакцию;

изменять специфичность работы ферментов.

Можно изменять также структурные свойств ферментов и других белков:

улучшать термостабильность;

улучшать стабильность к органическим растворителям;

изменять лиганд-связывающие свойства.

Наконец, можно получать новые белковые системы:

получать химерные и полифункциональные белки, - белки с «тагами» (от английского "tag" – привесок, обрывок) то есть со специальными полипептидными "хвостиками", которые могут, например, облегчать выделение и очистку, уменьшать токсичность решать сложные задачи по улучшению эффективности белковых лекарственных создавать совершенно новые искусственные («de novo») белки с заданной структурой и В литературе описано большое количество работ по белковой инженерии и далее в настоящем курсе мы будем подробно рассматривать некоторые типичные работы, выполненные на кафедре белковой инженерии. Начнем с рассмотрения основных этапов работы белкового инженера - схему эксперимента.

Постановка задачи, анализ, моделирование Получение экспрессирующей системы (плазмида, Оптимизация экспрессии, получение белка Исследование рекомбинантного белка Вначале исследователю необходимо решить, с каким белковым объектом и почему он собирается работать – это этап постановки задачи, требующий получения необходимой информации, анализа литературы, возможно, моделирования. Затем нужно получить ген того белка, с которым предстоит работать. Это довольно простой этап - ген можно получить, например, клонированием с кДНК, то есть с искусственно (с помощью специального фермента) полученной ДНК, комплиментарной матричным РНК организма, кодирующим все его белки. (Хромосомная ДНК в этом смысле хуже, т.к. в ней гены могут прерываться интронами, т.е. некодирующими участками). Ген можно также синтезировать химически, что иногда предпочтительнее, т.к. при этом можно сразу убрать редкие кодоны, затрудняющие экспрессию гена. Наконец, можно просто попросить у коллег (если он уже получен где-то) – вполне могут дать и даже прислать из-за рубежа. Затем надо получить систему экспрессии, то есть выбрать организм, в котором вы собираетесь производить белок и заставить его эффективно нарабатывать ваш белок. Обычно у нас это E.coli, но можно использовать и дрожжи, и клетки насекомых – бакуловирусная система, – и клетки млекопитающих, и бесклеточную систему экспрессии. Создание системы экспресии включает в себя получение экспрессирующей плазмиды и оптимизацию экспрессии, то есть подбор условий, в которых система будет производить наибольшее количество белкового продукта (или наибольшую долю растворимого белка, или наибольшую долю белка в составе телец включения – в зависимости от конкретного объекта и дальнейшей схемы его выделения и очистки). Это уже более сложная задача, которую не всегда удается решить. Проблемы могут быть разные – токсичный для клетки белок, его быстрый распад, неправильное сворачивание белка и, как следствие, отсутствие необходимой активности и т.д. Но если удается преодолеть эти проблемы и белок, наконец, получен, его можно детально исследовать различными физикохимическими методами, проанализировать, понять, как он работает и решить, что и зачем нужно поменять, то есть поставить задачу для работы белкового инженера. Иногда бывает и так, что менять ничего не надо – например, получен важный для медицины белок, который и так хорошо работает. Но даже в этих случаях часто возникают интересные вопросы и задачи, которые требуют работы белкового инженера. А когда мы знаем, что хотим улучшать, какой остаток или остатки изменить, мы используем мутагенез, получаем мутантные гены с необходимыми аминокислотными заменами и опять возвращаемся к началу схемы. Цикл повторяется, вновь идет исследование, анализ результата, возможно, постановка следующей задачи и т.д. И, таким образом, порой нужно пройти несколько таких последовательных стадий, прежде чем удастся получить что-то действительно нужное и интересное.

Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Какие элементы белковых структур Вы знаете?

2. Опишите схему эксперимента в белковой инженерии.

3. Придумайте пример задачи для работы белкового инженера.

4. Какие свойства белков можно изменять с помощью белковой инженерии?

5. Какова последовательность действий белкового инженера при решении типичной 3. Генно-инженерные методы белковой инженерии Генно-инженерные методы составляют экспериментальную основу белковой инженерии, поэтому исследователи, работающие в этой области, должны хорошо владеть основными генно-инженерными приемами и методиками. Это, прежде всего, рестрикция и лигирование плазмид и фрагменов ДНК, использование полимераз, в том числе, термостабильных полимераз для полимеразной цепной реакции, проведение мутагенеза.

К наиболее важным ферментам, применяющимся в генетической и белковой инженерии, относятся специфические эндонуклеазы – рестриктазы, с помощью которых получают фрагменты ДНК воспроизводимого состава и длины, а также ДНК-лигазы, объединяющие эти фрагменты.

Рестриктазы и метилазы В бактериях чужеродная ДНК, проникающая в клетки, гидролизуется (рестрицируется) с помощью специальных эндонуклеаз – рестриктаз, являющихся элементами системы рестрикции-модификации. Рестриктазы узнают в чужеродной ДНК определенные специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов – сайты узнавания – и расщепляют эту ДНК на отдельные фрагменты. Собственную ДНК рестриктазы не разрушают, поскольку она в этих же участках модифицируется сайтспецифическими метилазами. Метилазы – ферменты, присоединяющие метильную группу к определенным азотистым основаниям в ДНК. Они практически не используются в белковой инженерии, однако необходимо помнить о их существовании при проведении рестрикции, так как они (точнее, результат их работы – метилирование) могут препятствовать расщеплению ДНК рестриктазами. Ферменты рестрикции и модификации найдены практически у всех исследованных видов бактерий. Они могут также кодироваться фагами и плазмидами. Название рестриктаз складывается из первой буквы рода бактерий, и двух первых букв вида, например, Bacillus subtilis – Bsu, E.coli - Eco. При необходимости дается типовая характеристика штамма, например, Hinc обозначает фермент из клеток Haemophilus influenzae с серотипом с. Различные системы рестрикции одного и того же вида бактерий нумеруются римскими цифрами (PvuI и PvuII из Proteus vulgaris, AvaI и AvaII из Anabaena variabilis). С учетом основных свойств системы рестрикции-модификации подразделяются на 4 класса. Различия касаются: субъединичности строения, потребности в кофакторах, симметрии сайтов узнавания; положения сайтов разрезания относительно сайтов узнавания.

Более детальную характеристику различных рестриктаз можно найти в учебниках по генной инженерии, нас же для целей практической белковой инженерии, в первую очередь, интересуют рестриктазы второго класса, которые узнают симметричную последовательность из 4-8 нуклеотидов (могут также содержать несколько добавочных нуклеотидов в форме неспецифичных вставок). Сайты разрезания совпадают с сайтами узнавания или находятся рядом с ними на строго определенном расстоянии, что позволяет получать рестрикты строго определенной длины. Поэтому они широко применяются для самых различных целей, например, физического картирования ДНК, анализа полиморфизма ДНК, генетического конструирования рекомбинантных молекул in vitro; рестрикционный может использоваться в качестве точки отсчета при секвенировании ДНК и т.д. По способу расщепления рестриктазы второго класса подразделяются на 2 типа. Одни осуществляют ступенчатый разрез нитей, т.е.

положения гидролизуемых связей на разных цепях ДНК не совпадают. В результате у фрагментов ДНК образуются выступающие однонитевые концы. Очевидно, в местах разрезов выступающие последовательности нуклеотидов, относящиеся к разным нитям ДНК, являются комплиментарными (липкими) (рисунок 3). При этом выступать могут как 5’концы (например, при обработке ДНК рестриктазой EcoRI), так и 3’-концы (например, при обработке ДНК рестриктазой PstI). Другие рестриктазы второго класса осуществляют прямой разрез нитей ДНК - расщепляются совпадающие связи. В результате у фрагментов ДНК образуются ровные (тупые) концы (например, при обработке ДНК рестриктазой SmaI).

5’-N-N-С-T-G-C-A-G-N- 3’ PstI 5’-N-N- С-T-G-C-A-3’ 5’-G-N-3’ Рис. 3. Классификация рестриктаз по способу расщепления ДНК.

Для целей практической белковой инженерии – получения фрагментов ДНК и их последующего сшивания и/или введения в состав плазмид с помощь фермента лигазы используются и те и другие, однако на практике удобнее работать с липкими концами.

Многие рестриктазы, выделенные из разных бактерий, узнают на ДНК одинаковые сайты.

Такие рестриктазы называют изомерами. Они подразделяются на изошизомеры и гетерошизомеры. – одни узнают одинаковые сайты и одинаково их разрезают (например, рестриктазы HindIII и HsuI), а вторые расщепляют эти сайты по-разному (например, Asp718I и KpnI). Главные условия для работы рестриктаз – определенная температура и состав буфера (рисунок 4).

Оптимальная температура действия для большинства рестриктаз - 37оС. Но, например, рестриктаза SmaI предпочитает 25оС, а рестриктазы, выделенные из термофильных бактерий (например, TaqI), эффективны при 65оС. С целью удобства в работе для большинства рестриктаз существуют унифицированные варианты буферных растворов, в которых проводится реакция рестрикции. Важным условием работы рестриктаз является правильная ионная сила буферного раствора – в противном случае может наблюдаться т. наз.

"звездная активность", при которой рестриктаза может терять специфичность, т. е.

расщеплять ДНК не только в своем сайте рестрикции. Когда расщепление ДНК ведут двумя или большим количеством рестриктаз, то их добавляют одновременно при условии, если они способны правильно работать в одинаковом буфере. В противном случае первым используется фермент, требующий меньшей ионной силы. После его действия ионную силу раствора повышают и добавляют второй фермент. Типичный ферментативный гидролиз ДНК ведут в объеме 20 мкл, используя 0.1-1 мкг ДНК, 1 единицу фермента и буфер для его работы. Единица фермента (единица активности фермента) – количество рестриктазы, необходимое для полного расщепления 1мкг ДНК фага за 1 ч при рекомендованных условиях. Но в ряде случаев, когда сайтов узнавания для данной рестриктазы нет в ДНК фага, используются другие охарактеризованные молекулы - pBR322, аденовирусная ДНК.

Разнообразные генетические процессы (репликация, рекомбинация, репарация), протекающие в клетке, сопровождаются появлением в двунитевых молекулах ДНК ников, т.е. однонитевых разрывов. В таких молекулах 3’-ОН и 5’-р-концы разорванных полинуклеотидных цепей удерживаются вместе с помощью водородных связей с комплементарной нитью. ДНК-лигазы – ферменты, объединяющие подобные цепи путем восстановления фосфодиэфирной связи между двумя соседними полинуклеотидами.

Наиболее изучены ДНК-лигазы E.coli и фага Т4. Энергию, необходимую для образования ковалентных связей, эти ферменты черпают у кофакторов – макроэнергов НАД+ (бактериальная лигаза) или АТФ (фаговая лигаза). В обоих случаях ферменты аденилируются, а затем переносят АМФ на 5’-концы полинуклеотидных цепей в местах разрывов, что сопровождается восстановлением макроэнергетических пирофосфатных связей. Запасенная таким образом энергия тратится на образовангие фосфодиэфирных связей между соседними 3’-ОН и 5’-р-концами, что приводит к залечиванию ников и освобождению АМФ. Бактериальную и фаговую ДНК-лигазы используют для сшивания (лигирования) рестриктов. Оптимальная температура лигирования ДНК в никах 37оС, но при данной температуре энергии водородных связей между липкими концами рестриктов недостаточно для их удержания в совместном комплексе в момент реакции. Поэтому лигирование рестриктов проводят при пониженных температурах (4 – 12оС). ДНК-лигазу фага Т4 применяют в реакции объединения двунитевых фрагментов ДНК, содержащих тупые концы. Она катализирует образование фосфодиэфирных связей в обеих нитях.

Лигирование тупых концов обычно проводят при температурах 16 – 22оС.

ДНК-полимеразы – ферменты, ведущие матричный синтез ДНК в направлении 5’3’. Для этой цели им обязательно требуется праймер со свободной 3’ОН-группой. Более подробно познакомимся с ДНК-полимеразами на примере ДНК-полимеразы I E.coli.

ДНК-полимераза I E.coli. Этот фермент состоит из одной полипептидной цепи, и обладает тремя видами активности. Полимеразная активность обуславливает синтез цепи ДНК в направлении 5’3’. Он осуществляется на однонитевой матрице в присутствии dNTP присоединением нуклеотидных остатков к 3’ОН-концу комплементарной нити, являющейся в этом случае праймером. Экзонуклеазная активность в направлении 5’3’ вызывает отщепление нуклеотидов с 5’р-концов двунитевых молекул ДНК и приводит к их деградации. Экзонуклеазная активность в направлении 3’5’ приводит к отщеплению нуклеотидов с 3’ОН-концов одно- и двунитевых молекул ДНК. Данная активность на двуцепочечной ДНК блокируется 5’3’ полимеразной активностью. Эта ДНК-полимераза может вести одновременно полимеризацию и гидролиз нуклеотидной цепи в направлении 5’3’, начиная с однонитевого разрыва (ника) в двунитевой ДНК. При этом ник перемещается вдоль цепи ДНК (этот процесс назван ник-трансляцией), что и используется для введения в ДНК in vitro меченных нуклеотидов. Раньше ее использовали также при синтезе 2-ой цепи кДНК, в настоящее время для этой цели используется обратная транскриптаза или фрагмент Кленова ДНК полимеразы I. От ДНК-полимеразы I с помощью трипсина или субтилизина можно отделить домен, называемый фрагментом Кленова, который сохраняет полимеразную и 3’5’ экзонуклеазную активности. Отсутствие в кленовском фрагменте 5’3’ экзонуклеазной активности позволяет использовать его для заполнения нуклеотидами выступающих однонитевых 5’-концов, образующихся при ступенчатом разрезании ДНК рестриктазами. Фрагмент Кленова используется 1) для превращения липких концов ДНК в тупые для последующего лигирования; 2) для синтеза второй нити кДНК; 3) для концевого включения метки в фрагменты ДНК; 4) для секвенирования по методу Сэнгера.

ДНК-полимераза фага Т4. Этот фермент обладает теми же активностями, что и фрагмент Кленова. Однако 3’5’ экзонуклеазная активность этой полимеразы более эффективна.

ДНК-полимераза фага Т7. Этот фермент обладает теми же активностями, что и фрагмент Кленова. Он состоит из двух субъединиц: продукта гена 5 фага Т7 и вспомогательного белка тиоредоксина E.coli. Последний повышает стабильность комплекса фермент-матрица и увеличивает процессивность полимеразы более, чем в 1000 раз.

Благодаря этому его используют для копирования относительно длинных матриц. Для секвенирования по Сэнгеру используют модификации этой полимеразы, у которых экзонуклеазная активность подавлена. Эти модификации получили название сиквеназ.

Широкое распространение в генно-инженерной практике получили термостабильные ДНК-полимеразы, о которых речь пойдет позднее.

Полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение 2-3 часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в сотни миллионов раз. На рисунке 4 показана схема полимеразной цепной реакции.

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК. Эффект умножения специфической последовательности ДНК достигается путем многократного повторения (25-30 циклов) трех последовательных реакций: 1) температурной денатурации ДНК, 2) связывания (отжига) праймеров с комплементарными последовательностями ДНК, т.е. образования двухцепочечных "комплексов" праймер-матрица, необходимых для инициации синтеза ДНК;

и 3) последующей достройки цепей ДНК с этих праймеров в направлении от 5’-конца к 3’концу цепи, начиная с участков присоединения праймеров, при помощи термостабильной ДНК-полимеразы. Праймеры на матрице ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. При этом длинные фрагменты, синтезируемые на исходной цепи ДНК, накапливаются по формуле арифметической прогрессии, а короткие дискретные фрагменты, ограниченные на концах праймерами, которые впервые появляются только в конце второго цикла ПЦР, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

Смена типа реакции задается изменением температуры реакционной смеси.

Температура денатурации определяется ионной силой используемого буфера и концентрацией дестабилизирующих ("денатурирующих") ДНК агентов (если они есть). Чем ниже ионная сила и чем выше концентация "денатурирующих" агентов, тем ниже температура, при которой происходит денатурация ДНК. Температура отжига определяется строением праймера. Температура полимеризации определяется свойствами используемой полимеразы (например, для Taq-полимеразы это 72оС). В настоящее время метод ПЦР автоматизирован, довольно прост в исполнении и доступен любой молекулярнобиологической лаборатории. Для получения ответа на интересующие вас вопросы дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, ДНК-полимеразу, концентрированный буферный раствор и поместить пробирку в программируемый термоциклер (амплификатор), который по заданной программе автоматчески проводит смену температур. Число циклов ПЦР ограничено, с одной стороны, частичной инактивацией полимеразы и истощением участвующих в реакции праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, а с другой - тем, что избыточное число циклов приводит к наработке продуктов неспецифической амплификации. В большинстве случаев для проведения ПЦР достаточно 25-30 циклов.

Для подбора праймеров можно использовать простые компьютерные программы, например Oligo. Требования к нуклеотидной последовательности праймера можно свести к следующим условиям: 1) отсутствие вторичной структура (праймер не должен образовывать петли); 2) сбалансированный состав ГС, АТ-пар и равномерное распределение ГС, АТ по всей последовательности; 3) праймеры не должны быть гомологичны друг другу.

Выбор температуры отжига праймеров, возможно, один из ключевых факторов для обеспечения высокоспецифичной ПЦР. Если температура окажется завышенной, отжиг не будет происходить, если будет занижена – резко увеличится неспецифический отжиг, что привет к синтезу неспецифических продуктов.

Для точного расчета оптимальной температуры отжига праймера (по его нуклеотидному составу) существует множество различных программ и алгоритмов.

Упрощенный расчет можно провести, используя следующие формулы:

если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований.

Tm = 22 + 1.46( + (A+T)), или где M - ионная сила раствора, L - длина олигонуклеотида, если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований.

В ПЦР используются термостабильные ДНК-полимеразы; одна из самых популярных из них - Taq-полимераза. Фермент изначально был выделен из термофильных бактерий Thermus aquaticus, поэтому он сам термостабилен – реплицирует ДНК при 72оС и сохраняет половину своей функциональной активности после прогрева при 95оС в течение одного часа. Фермент обладает 5’3’ экзонуклеазной активностью, но редакторская 3’5’ экзонуклеазная активность у него слабая. Поэтому Taq-полимераза имеет довольно высокий процент ошибочного (некомплиментарного) включения нуклеотидов in vitro. Теми же активностями что и Taq-полимераза, обладает Tth-полимераза (выделена из термофильных бактерий Thermus thermophilus). Часто используются ДНК-полимеразы Vent и Deep Vent, которые происходят из бактерий, найденных в глубоководных термальных источниках.

Полимеразы высоко термостабильны: сохраняет половину своей функциональной активности после прогрева при 95оС в течении 7 (Vent) и 23 (Deep Vent) часов. Ферменты обладают 3’5’ экзонуклеазной активностью, поэтому точность синтеза повышена на порядок по сравнению с Taq-полимеразой. Pfu- полимераза – еще один фермент, выделенный из термофильных бактерий. Обладает теми же активностями что и Vent и Deep Vent ДНКполимеразы, при этом точность синтеза выше, чем у этих полимераз.

Клонирование ПЦР-фрагментов. При клонировании ПЦР-продукта нужно помнить о некоторых особенностях работы определенных термостабильных полимераз. Taq и Tthполимеразы имеют специфическую особенность навешивать дополнительные адениловые остатки к 3’-концу ПЦР-продукта. Такие фрагменты не могут быть клонированы, их необходимо подвергнуть предварительной обработке. Для этого используются различные способы: «полирование концов продуктов» – достраивание синтезированной ДНК с помощью фрагмента Кленова, с последующим фосфорилированием, которая осуществляет полинуклеотид киназа. Можно также вводить в используемые праймеры дополнительные сайты рестрикции. С этой целью дополнительная последовательность нуклеотидов синтезируется на 5’-конце праймеров. В первом цикле праймеры связываются с ДНК только своей 3’-концевой частью, но уже в последующих циклах дополнительная последовательность включается в синтезируемую ДНК и праймеры гибридизуются с ней по всей длине. Так обычно снабжают синтезированный ПЦР-продукт сайтами рестрикции, обеспечивая с их помощью возможность его дальнейшего клонирования.

Область применения ПЦР велика и постоянно расширяется – рисунок 5.

1. Клонирование нуклеотидных последовательностей;

6. Обнаружение генетического материала микроорганизмов Рис. 6. Области применения полимеразной цепной реакции.

Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Какие генно-инженерные методы используются в белковой инженерии?

2. Какие ферменты, используемые в белковой инженерии, Вы знаете?

3. Какие типы рестриктаз Вы знаете?

4. Могут ли рестриктазы расщеплять метилированные участки ДНК?

5. Что такое ПЦР?

4. Системы экспрессии генов. Прокариотические и эукариотичексие системы.

Как уже было сказано, получить ген сейчас достаточно просто, а вот получить хорошую систему экспрессии для производства белка удается не всегда. В настоящее время применяются следующие способы экспрессии:

1. Прямая экспрессия, когда белок синтезируется со своего гена, включенного в плазмиду и поставленного под контроль необходимых регуляторных элементов, не имеет никаких вспомогательных "довесков" и остается в цитоплазме;

2. Гибридная экспрессия – то же самое, но с довеском в виде белка-помощника, находящегося на N-конце полипептидной цепи и отщепляемого (или не отщепляемого) впоследствии;

3. Секреция, когда белок выводится в периплазматическое пространство (пространство между внутренней мембраной - фосфолипидным бислоем, - и внешней мембраной клетки, состоящей из пептидогликанового слоя и своего фосфолипидного бислоя;

периплазма важна для осморегуляции клеток, в ней находятся некоторые белки) или Каждый из способов имеет свои особенности. При прямой экспрессии ген целевого белка ставится в плазмиду под контроль хорошего промотера, который, впрочем, обеспечивает эффективный синтез далеко не всегда: гетерологичный ген может иметь "неправильную" последовательность, например, образующую в мРНК вторичную структуру, продукт синтеза может разрушаться клеточными протеазами или быть токсичен для клеткихозяина. Цель гибридной экспрессии – "перехитрить" клетку, заставив ее эффективно начать синтез N-концевой части белка-помощника, в качестве которого берут белок, заведомо хорошо экспрессируемый хозяйской клеткой (т. наз. house-keeping белки - "белки домашнего хозяйства"). После же начала синтеза ген белка-помощника переходит в целевой ген, так что получаемая полипептидная цепь представляет собой целевой белок с небольшим довеском от белка-носителя на N-конце. При необходимости этот довесок можно отщепить с помощью высокоспецифических протеаз (для этого между геном белка-помощника и целевым геном вводится специальный участок, кодирующий сайт расщепления такой протеазы. Секреция позволяет вывести вновь синтезированный целевой белок в периплазму или за пределы клетки, что может облегчить его последующее выделение и очистку. Кроме того, таким образом можно иногда получить эффективную эспрессию белков, токсичных для клетки, так как синтезированная полипептидная цепь выводится за пределы цитоплазмы.

По клеткам-хозяевам системы экспрессии можно разделить на прокариотические и эукариотические. Традиционно получили большое распространие прокариотические системы экспрессии, прежде всего, экспрессия в E.coli. Среди ее достоинств – простота и доступность, возможность достижения высокого уровня продукции целевых белков, хорошая воспроизводимость результатов, относительная дешевизна, изученность свойств хозяина – клеток E.coli. К недостаткам надо отнести отсутствие ко- и пост-трансляционных модификаций гетерологичных белков, например, белков человека, нативность и полное соответствие природным которых весьма важно для их использования в качестве лекарственных препаратов. Также достаточно давно ведутся работы по экспрессии в дрожжах – эта эукариотическая система экспрессии тоже хорошо изучена и отработана.

Уровень экспрессии белков здесь обычно ниже, чем в E.coli, однако, он бывает достаточно высок (например, в дрожжах Pichia pastoris). Дрожжи обеспечивают часть ко- и посттрансляционных модификаций гертерологичных белков, однако эти модификации могут отличаться от "родных", т.е., тех модификаций, которые имеет данный белок в своем природном организме-хозяине. Другая достаточно часто используемая эукариотическая система экспрессии - это бакуловирусная система, когда белки экспрессируются в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом, который несет ген целевого белка. В последнее время все большее распространение получают системы экспрессии в клетках млекопитающих, например, СНО - клетках яичника китайского хомячка. Такие системы экспрессии позволяют полностью избежать проблем с ко- и пост-трансляционными модификациями белка (которые могут быть "неправильными" у дрожжей и вообще отсутствовать у E.coli). Значительная часть современных белковых лекарственных препаратов производится именно в клетках млекопитающих, и эта часть, несомненно, будет расти. И это несмотря на высокую стоимость экспрессии в клетках млекопитающих.

Причина заключается в том, что в цене лекарственного препарата-белка доля затрат на собственно производство белка составляет всего несколько процентов, а все остальное – это расходы на НИР по разработке препарата, на его доклиническое и клиническое тестирование, продвижение на рынок и т.д. И если белковый препарат, условно говоря, стоит на рынке 1000 долларов, то не столь уж важно, составляет ли стоимость его производства на фармацевтическом заводе 10, 50 или 100 долларов.

Мы не будем сейчас останавливаться на "традиционных" способах экспрессии (о которых можно прочитать в учебниках), а рассмотрим подробнее бесклеточные системы, которые не столь сильно распространены, но обладают уникальными возможностями.

Бесклеточные белоксинтезирующие системы - одна из самых сложных многокомпонентных наносистем, используемых молекулярными биологами in vitro. Это связано с необходимостью точного воспроизведения всех этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Бесклеточные системы были вначале разработаны именно для исследования механизмов биосинтеза белка, и только потом стало понятно, что с их помощью можно также нарабатывать рекомбинантные белки и пептиды в аналитических, а затем и препаративных количествах.

В бесклеточную систему обязательно входит клеточный экстракт, получаемый после разрушения клеток и освобождения супернатанта от дебриса (и содержащий многие необходимые для синтеза компоненты, роль которых порой неясна), а также матричная РНК с геном целевого белка, аминокислоты, источник энергии (ГТФ) и другие химические соединения, значение которых в процессе синтеза, напротив, хорошо известно. Клеточный экстракт – важнейший компонент бесклеточной системы, его получение – своего рода искусство, которое требует строгого соблюдения протоколов, точности и аккуратности; от качества экстракта зависит эффективность работы системы. Химические соединения, роль которых в процессе синтеза известна, могут добавляться в реакцию в модифицированном виде и это - одно из существенных преимуществ бесклеточной системы. Например, если вместо обычных аминокислот добавить их изотопно меченные (15N и/или 13С) аналоги, то эффективность работы системы практически не изменится, а синтезированный белковый продукт будет пригоден для детального структурного исследования методом ЯМР.

Напротив, в клеточных системах экспресии получение изотопно меченного продукта представляет достаточно сложную задачу. Еще одно очевидное преимущество бесклеточной системы – возможность синтеза токсичных для живой клетки белков, которые могут быть не столь токсичны для белок-синтезирующей машины бесклеточной системы.

Бесклеточные системы экспресии, подобно другим системам, можно разделить на прокариотические и эукариотические – в зависимости от используемого клеточного экстракта. Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, среди эукариотических – на основе ретикулоцитов кроликов и зародышей пшеницы. Естественно, что наиболее эффективно различные белки производятся в гомологичных бесклеточных системах, однако и чужеродные мРНК могут быть весьма успешно транслированы. При этом мРНК может либо нарабатываться в необходимых количествах in vitro заранее и добавляться в реакцию, или же синтезироваться в процессе самой реакции параллельно с трансляцией такая система называется сопряженной. Бесклеточные системы экспресии весьма дороги, поэтому их чаще используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. При этом система обычно работает несколько часов, затем эффективность синтеза падает вследствие деградации ее компонентов, накопления продуктов реакции, ингибирующих процесс и т.п. Этого можно избежать, используя проточную белоксинтезирующию систему, в которой непрерывно происходит удаление продуктов реакции и добавление расходуемых веществ, необходимых для работы системы.

Экстракты клеток, используемые в бесклеточных системах, содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков, разрушают мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих проблем в бесклеточных системах могут использоваться экстракты мутантных клеток, дефектных по РНКазам и полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п. Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия, особенно концентрацию ионов Mg2+. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg2+ в системе на 1-2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. Влияние ионов Mg2+ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, повидимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+. В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са2+ и даже Мn2+, а также частично замещены полиаминами:

спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков. Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов K+ или NH4+, оптимальные концентрации которых составляют около 100 мМ. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов Сl-. Ионы Mg2+, К+ и NH4+ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме.

Для производства белков человека и других высших организмов применяются эукариотические бесклеточные системы, в частности, системы из ретикулоцитов кроликов и зародышей пшеницы, а также системы на основе культивируемых соматических клеток различного происхождения. Системы всех трех типов могут быть использованы с одинаковым успехом для трансляции разнообразных мРНК и, как правило, не обнаруживают видоспецифичности. Ретикулоциты - безъядерные предшественники эритроцитов человека и животных, они осуществляют активный синтез гемоглобина и обладают всеми необходимыми компонентами белкового синтеза. Отсутствие у них ядер дает возможность получать бесклеточные экстракты, минимально загрязненные геномной ДНК. Бесклеточные системы на основе зародышей пшеницы содержат экстракт, выделяемый из сухих зерен озимой пшеницы. Возможность длительного хранения и доступность этого биологического материала обеспечивает хорошую воспроизводимость получаемых результатов Несмотря на то, что различные эукариотические бесклеточные белоксинтезирующие системы активно транслируют гетерологичные мРНК, гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно. Например, глобиновые мРНК транслируются на порядок лучше лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников китайских хомячков.

Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции определенных мРНК.

Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. В каком виде можно экспрессировать целевые белки?

2. Какие системы экспрессии Вы знаете?

3. В чем преимущества и недостатки бактериальной системы экспресии в E.coli?

4. Что такое бесклеточная система экспресии?

5. Для чего в бесклеточную систему экспресии добавляют клеточный экстракт?

6. Можно ли создать "чистую" бесклеточную систему, содержащую только изолированные и очищенные компоненты белок-синтезирующей машины?

5. Экспрессия генов и препаративное получение целевых белков в практической Каждый способ экспресии гена обладает своими достоинствами и недостатками и конкретный выбор системы экспресии, очевидно, зависит от задачи, т.

е. свойств белка, который нам надо получить. При этом требования к системе экспрессии, по сути, одни и те же: стабильность (воспроизводимость), высокий выход продукта, простота выделения, правильная пространственная структура. Отсутствие правильной структуры у экспрессируемого белка может приводить к его деградации и, как следствие, невысокому выходу продукта. Или можно будет получить достаточные количества белка в виде телец включения, но ренатурировать такой белок удается далеко не всегда. То есть синтезированный полипептид имеет правильную первичную структуру (что легко проверяется секвенированием гена), которая, однако, не может сложиться в нативную функционирующую пространственную. Понятно, что такой белок, нам не нужен и необходимо добиваться получения правильно сложенного белка. Именно этот этап – создание эффективной системы экспресии и получение нативного белка часто является ключевым в работе белкового инженера. Весьма характерна ситуация, когда длительное время не удается создать такую систему для какого-либо редкого и сложного белка и его исследование осуществляется очень медленно на тех небольших количествах препарата, которые удается наработать из природного источника (например, яда змеи). Но, как только получена эффективная система экспрессии, белок немедленно выделяется в больших количествах, идет его интенсивное изучение, расшифровывается структура, становится возможным исследовать структурно-функциональные отношения в молекуле белка с помощью направленного мутагенеза. В результате за короткий срок мы узнаем об этом объекте гораздо больше, чем за многие предыдущие годы, когда в руках исследователей были лишь микроколичества природного материала. В качестве конкретного примера рассмотрим нейротоксин II – белок из яда кобры Naja oxiana, для которого длительное время не удавалось получить эффективную систему экспрессии. Как только же эта задача была решена - не без участия сотрудников кафедры биоинженерии - исследования нейротоксина вышли на качественно новый уровень.

Рис. 7. Пространственная структура нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana На рисунке 7 показана его структура – это очень интересный небольшой белок с 4мя дисульфидными связями (именно эти дисульфидные связи и были камнем преткновения при его экспрессии). Нейротоксин II специфически взаимодействует с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами, встроенными в клеточную мембрану, которые играют роль в возникновении и развитии целого ряда болезней нервной системы (болезни Альцгеймера, эпилепсии, шизофрении и др.), а также в возникновении никотиновой зависимости у курильщиков. Понятно, что возможность блокирования и регулировки таких рецепторов имеет очень большое научно-практическое значение. Нейротоксин II был впервые описан более 20 лет тому назад, но работы с ним шли медленно в связи с тем, что белок длительное время удавалось получать только из яда змей в очень ограниченных количествах.

Рекомбинантный же белок получить не удавалось - при прямой экспрессии он был неактивен, так как наличие четырех дисульфидных связей на такой небольшой белок приводили к его неправильному сворачиванию в цитоплазме. В случае же гибридной экспрессии с тиоредоксином удавалось получать доли миллиграмма с литра культуры, причем процесс выделения и очистки был очень длительным и трудоемким. Задачу удалось решить лишь путем использования системы экспрессии с секрецией целевого белка, причем ключевым моментом в данном случае был подбор правильной лидерной (сигнальной) последовательности, наличие которой в полипептидной цепи приводит к секреции продукта.

также была найдена очень простая методика выделения этого белка, основанная на его высокой термостабильности. Дело в том, что нейротоксин выдерживает нагревание до градусов по Цельсию в растворе, в то время как большинство других белков при такой температуре денатурируют и выпадают в осадок. Поэтому одним из ключевых и самых эффективных этапов очистки белка оказался прогрев раствора, содержащего клеточные белки, при температуре 70 градусов с последующим центрифугированием. После этого в супернатанте оставался уже довольно чистый нейротоксин. В результате использования этой системы экспрессии был получен выход на бедной среде до ~15 мг/л, на богатой ~150 мг с литра культуры, то есть на порядок больше того, что было достигнуто другими исследователями. Понятно, что такая экспрессия вывела работу с нейротоксином на качественно новый уровень - стало возможным получать и исследовать различные мутанты этого белка, ставить и решать новые интересные задачи, о которых стоит здесь рассказать.

Проверка правильности структуры нейротоксина II (и чистоты полученного продукта) была выполнена с помощью спектроскопии ЯМР. Путем культивирования штамма-продуцента нейротоксина на среде, содержащей N15 меченый хлористый аммоний, удалось добиться того, что все азоты в белке были не обычные N14, а изотопы N15. Они показаны на рисунке 8 слева синими кружочками.

Рис. 8. Слева молекула нейротоксина, меченнного N15 (синие кружочки), справа – спектр ЯМР, Был получен спектр ЯМР с корреляцией химических сдвигов ядер N15 и протонов и проведено отнесение сигналов, которое показало, что сигналы всех ядер N15 белка присутствуют в этом спектре, их положение соответствует спектру нативного белка и в спектре отсутствуют сигналы от каких-либо примесей. Количественный анализ позволил сказать, что, по крайней мере 99% присутствующего в образце белка соответствует искомому продукту. Конечно, была проверена также биологическая активность генноинженерного белка и она совпала с активностью токсина, выделенного из яда змеи. Таким образом, использование секреции и выращивания белка в среде, содержащей N15, позволило нам получить желаемый продукт в больших количествах и использовать его для дальнейшего изучения ставить задачи по мутагенезу нейротоксина, которые были совершенно невозможны без такой системы экспрессии. Вот одна из этих задач.

Известно, что -нейротоксины змеиного яда делятся на два класса: короткие нейротоксины и длинные нейротоксины с дополнительной дисульфидной связью на кончике центральной петли (рисунок 9). Длинные и короткие токсины проявляют различную избирательность по отношению к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам (нАХР). С рецепторами мускульного типа (то есть, имеющимися на поверности мышечных клеток) одинаково хорошо взаимодействуют токсины обоих типов, в то время как с рецепторами нейронального типа, находящимися на нейронах, эффективно взаимодействуют только длинные токсины. Сравнительный анализ структур -нейротоксинов позволил предположить, что ключевую роль в специфичности распознавания того или иного типа рецепторов играет, по-видимому, центральная петля молекулы -нейротоксинов.

Рис. 9. Сравнение пространственных структур нейротоксинов. Зеленым цветом показана центральная петля нейротоксина I с доплнительной дисульфидной связью (желтая линия).

Выяснилось, что эта петля похожа по своим структурным параметрам на короткие молекулы альфа-конотоксинов, которые хорошо связываются с рецепторами.

Было решено попробовать изменить специфичность нейротоксина II. С помощью метода сайт-направленного мутагенеза в молекулу короткого нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana был пересажен фрагмент центральной петли длинного нейротоксина I из яда этой кобры, и был получен мутантный вариант нейротоксина II c модифицированной центральной петлей, содержащей пятую дисульфидную связь. Проведенные исследования биологической активности рекомбинантного белка показали, что модифицированный нейротоксин II обладает сходной с нейротоксином I активностью по отношению к нейрональному никотиновому ацетилхолиновому рецептору, то есть, фактически, теми же самыми значениями Kd, что и исходный родительский белок, Таким образом, в результате этой работы нам удалось привить короткому нейротоксину из яда кобры способность эффективно взаимодействовать с нАХР нейронального типа. При этом существенно, что ключевым моментом, позволившим поставить и решить эту задачу, было получение эффективной системы экспрессии. Ведь мутанты часто экспрессируются заметно хуже, чем нативный белок (так было и в этом случае), поэтому без хорошей системы экспрессии просто не удалось бы наработать необходимые количества этих белков для их исследования. Изучение структуры нейротоксина методом ЯМР поставило очередные новые задачи для белковой инженерии этого белка. Было показано (с помощью метода гетероядерной спектроскопии), что при взаимодействии нейротоксина II с нАХР первая петля нейротоксина взаимодействует также и с поверхностью модельных липидных бицелл, состоящих из смеси двух детергентов, DMPC и DHPC и образующих аналог фосфолипидного бислоя клеточной мембраны. По-видимому, процесс блокировки канала нАХР происходит следующим образом: нейротоксин сначала садится на мембрану постсинаптической клетки, затем, диффундируя по мембране, находит рецептор, и происходит ингибирование рецептора токсином. Как можно подтвердить эту гипотезу? Очевидно, с помощью мутагенеза остатков, участвующих во взаимодействии с липидным окружением рецептора - изучая влияние мутаций в этих положениях на взаимодействие с рецептором в природном окружении и на взаимодействие с модельными мембранами. То есть здесь мы видим, как новые возможности белковой инженерии позволяют решать новые задачи, которые, в свою очередь ставят другие вопросы, для решения которых опять-таки нужна белковая инженерия.

Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. Какими свойствами должна обладать эффективная система экспрессии с точки зрения белкового инженера?

2. Означает ли получение полипептидного продукта с правильной первичной структурой решение задачи создания эффективной системы экспрессии?

3. В чем особенности нейротоксина II как объекта для препаративной гетерологичной экспрессии?

4. Как можно изменить специфичность взаимодействия нейротоксина с рецептором?

5. Какой из физико-химических методов исследования белковых молекул способен предоставить наибольшую информацию о молекуле белка в растворе?

Генно-инженерные белки, экспрессируемые в гетерологичных системах, часто не могут приобрести в клетке-хозяине или бесклеточной системе правильную пространственную структуру, обладающую биологической активностью. При этом белок может находиться в растворимом виде, но не иметь правильной структуры, или же образовывать нерастворимые агрегаты – тельца включения. Для того, чтобы привести такие белки в нативное состояние, необходимо их ренатурировать, вначале переведя в растворимое состояние с помощью сильных растворителей, а затем, постепенно убирая растворители, создать условия для правильного сворачивания белка. Ренатурация - это не простой, одноэтапный процесс, часто это достаточно нестандартная задача, не имеющая быстрого решения. Рассмотрим более подробно ренатурацию рекомбинантных белков из телец включения, образуемых при экспресии гетерологичных белков в E.coli. Тельца включения представляют собой частицы, состоящие, в основном, из агрегатов рекомбинантного белка, однако, они могут включать в себя также некоторое количество собственных бактериальных белков, "захваченных" чужеродным белком. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидингидрохлорид и детергенты. Солюбилизированный в этих жестких условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации требует дальнейшей ренатурации, и поэтому задачей солюбилизации является не только получение мономолекулярного раствора белка, но и минимизация неприродных внутри- и межбелковых взаимодействий. Выбор солюбилизирующего агента (мочевина, гуанидинхлорид, детергенты и т.д.) определяет не только эффективность растворения телец, но и структуру денатурированного белка в растворе, а, значит, и пути его дальнейшей ренатурации.

Ренатурацию обычно индуцируют, снижая концентрацию денатурирующего агента. При этом процесс образования нативной пространственной структуры белка может сопровождаться и неправильным сворачиванием белка или агрегацией, которые ведут к получению неактивного белка. Соотношение этих процессов – "правильного" и "неправильного" – во многом зависит от процедуры снижения концентрации денатуранта и от свойств растворителя. Большие возможности открывает применение специальных добавок, осмолитов и химических шаперонов, которые стабилизируют правильно сложенные белки и облегчают процесс ренатурации. Получение белка из телец включения можно разделить на две фазы: растворение телец и последующая ренатурация белка.

Наиболее часто для растворении телец включения используются мочевина, гуанидингидрохлорид и сильные ионные детергенты, такие, например, как Nлаурилсаркозин. Растворение в мочевине и в гуанидинхлориде приводит к появлению неупорядоченной лабильной структуры белков, в то время, как структура белков в растворе детергента может быть самой различной. Известно, например, что комплексы белков с SDS содержат большое количество альфа-спиралей. Ионные детергенты являются наиболее сильными растворителями, в которых вероятность образования агрегатов минимальна. В тоже время сохранение структуры белка в комплексе с детергентом повышает вероятность образования внутрибелковых дисульфидных связей, как нативных, так и «неправильных», неприродных. Эффективность растворения и разворачивания белков в присутствии мочевины и гуанидинхлорида зависит от их концентрации. В большинстве случаев оптимально использовать 6-8 М мочевину и 6-7 М гуанидинхлорид, однако, даже при более высоких концентрациях в белке могут сохраняться некоторые меж- и внутримолекулярные взаимодействия, и эти взаимодействия могут вести к образованию неправильных структур и агрегатов при последующем элиминировании денатуранта. Необходимо отметить, что природные дисульфидные связи могут образовываться даже в развернутых белках в присутствии денатурантов, так как природная структура белка термодинамически наиболее выгодна. Для более эффективной ренатурации белка можно использовать промежуточные концентрации денатурантов (мочевины и гуанидингидрохлорида), при которых их связывание с белками ослаблено. Этот прием невозможен в случае детергентов, так как их связывание с белком определяется критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), то есть такой концентрацией детергента, при которой он начинает образовывать мицеллы, на поверхность которых встаивается развернутый белок. Эффективное растворение белков происходит лишь при концентрации выше ККМ. Это означает, что ренатурация белка должна происходить в присутствии детергента. При убирании детергента еще не свернувшийся денатурированный белок, как правило, выпадает в осадок.

Ренатурация - это процесс сварачивания развернутой молекулы белка в правильную природную, биологически активную конформацию. Растворенные из телец включения белки не могут свернуться при высоких концентрациях денатурантов, они сольватированы и очень подвижны. Напротив, в водных растворах белки свернуты и компактны. В идеальных случаях перевод молекулов белка из денатурующих растворов в водный раствор должен приводить к сворачиванию. Однако, при быстром снижении концентрации денатурантов белки, как правило, образуют компактные, но неправильно сложенные структуры, склонные опять к агрегации. В этом случае белок утрачивает подвижность, что затрудняет возможность дисаггрегации и складывания нативной структуры. Ренатурация белка требует длительного присутствия промежуточных концентраций денатуранта, при которых белок еще сохраняет растворимость и подвижность, но уже склонен к сворачиванию. Исследования равновесных процессов ренатурации показали, что важную роль играют образующиеся в присутствии денатурантов промежуточные состояния белка. Эти структуры нестабильны и успешная ренатурация требует их перехода в нативную структуру при одновременном поддержании растворимости и подвижности. Дисульфид-содержащие белки, в принципе, могут складываться даже при высоких концентрациях денатуранта, если условия инкубации способствуют образованию дисульфидных связей. Однако, для ускорения образования и повышения вероятности формирования «правильных» связей все же необходим подбор оптимальной промежуточной концентрации денатуранта. Даже получение «правильных»

дисульфидных связей еще не гарантирует образование нативной структуры белка при элиминировании денатуранта. В этом случае определяющим является баланс между подвижностью белка и стабильностью нативной структуры. Поиск оптимального режима ренатурации начинается с выбора метода снижения концентрации денатуранта. Используют два способа снижения концентрации денатуранта в растворе: диализ и гель фильтрация.

Метод диализа основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором.

После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке будет тот же, что и в окружающем растворе. Наиболее простым подходом служит одностадийный диализ. В этом случае белок продолжительное время оказывается в растворе с промежуточной концентрацией денатуранта, которая медленно снижается. Этот подход прменяется для белков, которые сохраняют растворимость в развернутом или промежуточном состояниях. Важно, что при диализе концентрация белка остается практически постоянной, если не считать небольшого повышения объема за счет высокой осмолярности мочевины и гуанидина. Это означает, что ход ренатурации может критически зависеть от исходной концентрации белка. В некоторых случаях (например, при ренатурации антител) применяется ступенчатый диализ. При этом на каждом шаге устанавливается равновесие белка с определенной промежуточной концентрацией денатуранта.

Преимущества этого подхода проявляются в случае белков с дисульфидными связями, а также мультидоменных белков. Одним из вариантов этого метода является диализ против раствора с переменной концентрацией денатуранта. В этом случае диализный раствор исходно содержит высокую концентрацию денатуранта, которую затем постепенно снижают.

При быстром снижении эта методика близка к одностадийному диализу, а при медленном – к многосупенчатому.

При гель-фильтрации для того, чтобы освободиться от денатурантов, раствор денатурированного белка наносят на колонку, уравновешенную с буфером для ренатурации.

Использование колонок с крупнопористым гелем позволяет быстро отделить ренатурант, не фракционируя белки. Колонки с мелкопористым гелем могут обеспечить одновременное фракционирование белков по размеру. В обоих случаях постепенное снижение концентрации денатуранта происходит так же, как и при одностадийном диализе. Проблемы, связанные с соотношением скоростей убирания денатуранта и сворачивания белков, совпадают при обоих подходах. Различия определяются эффектами гелевого матрикса колонки на ренатурацию белков. Матрикс может взаимодействовать с белком благодаря гидрофобным взаимодействиям или образуя водородные связи при промежуточных концентрациях денатуранта и, таким образом препятствовать неправильному сворачиванию и агрегации.

Матрикс может так же способствовать дисперсии белков, уменьшая их агрегацию. Такой подход был, например, успешно использован для ренатурации интерлейкина-6 из раствора гуанидинхлорида. В этом случае белок был окислен в присутствии денатуранта, что привело к образованию правильных дисульфидных связей, а затем гуанидин был удален на колонке с Сефадексом G-25. Только после этого наблюдалась ренатурация активного белка.

Концентрацию денатуранта можно быстро понизить и простейшим образом, разведя образец в большом объеме буфера для ренатурации. При этом практически не возникает промежуточных концентраций денатуранта. При быстром разведении с большой вероятностью образуются компактные белковые структуры с низкой подвижностью, что ограничивает возможность флуктуаций и перестроек с образованием нативной структуры.

Для снижения этого эффекта рекомендуется добавка небольших концентраций денатуранта в раствор для ренатурации. Значение этой концентрации определяется стабильностью свернутого белка. В случае олигомерных белков проблемы могут возникать из-за низкой концентрации мономерных ренатурированных белков на ранних стадиях разведения. Чтобы обеспечить возможность олигомеризации возможно ускорить процедуру разведения.

Особым случаем разведения является «обратное разведение», когда буфер для ренатурации добавляется в раствор денатурированного белка. При этом концентрации белка и денатуранта снижаются одновременно. В этом случае высокая концентрация белка сохраняется при промежуточных концентрациях денатуранта, что может приводить к агрегации. С другой стороны, если промежуточные состояния белка сохраняют растворимость при промежуточных концентрациях денатуранта, то этот протокол оказывается предпочтительнее, так как дает белку время для медленных перестроек и сворачивания. Другой способ разведения основан на смешивании растворов белка и ренатурирующего буфера при определенном соотношении объемов. В течение этой процедуры концентрации белка и денатуранта остаются постоянными, в отличие от методик прямого и обратного разведения. Ход сворачивания белка и возникающие проблемы практически совпадают с теми, что характерны для прямого разведения. Если для предотвращения агрегации необходимо поддержание низкой концентрации денатурированного белка, то рекомендуется процедура прерывистого разведения. После добавления аликвоты денатурированного белка в раствор для ренатурации необходимо сделать паузу перед добавлением следующей аликвоты. Этот подход дает преимущество лишь в том случае, если свернутый белок не агрегирует в несвернутой или промежуточной формах.

Ренатурация белка может происходить с большей эффективностью, если он связан с аффинным матриксом (напр. Ni-содержащим носителем) или ионно-обменной смолой.

Связывание белка при этом происходит в присутствии денатуранта, который затем удаляют, промывая колонку. Эта процедура минимизирует опасность агрегации как развернутой, так и промежуточных форм белка. Главным недостатком этого метода являются стерические препятствия, возникающие при сворачивании белка, связанного с матриксом, в особенности, если это связывание является многоточечным. Эти проблемы можно частично преодолеть, если проводить ренатурацию в условиях частичной диссоциации, когда происходят флуктуации между связанным и свободным состоянием белка в процессе сворачивания.

Различные низкомолекулярные вещества могут ускорять процесс ренатурации белка.

Эти вещества могут быть разбиты на две группы: усиливающие сворачивание белка и препятствующие его агрегации. Эти два типа веществ могут оказывать отчасти противоположное действие. Усиление сворачивания белка, как правило, означает усиление белок-белковых взаимодействий, что может усилить агрегацию. Вещества, подавляющие агрегацию, должны преимущественно взаимодействовать с промежуточными формами белков, не влияя на процесс сворачивания. Этим требованиям удовлетворяют полиэтиленгликоль, циклодекстрин, аргинин хлорид и пролин. Полиэтиленгликоль и циклодекстрин, по-видимому, связываются с гидрофобными участками промежуточных форм белка, предотвращая их агрегацию. Наиболее часто на практике используется аргинин, но механизм его действия не до конца ясен. Показано, что аргинин не стабилизирует структуру белков и не усиливает сворачивание, но предотвращает агрегацию в процессе ренатурации. Известно, что многие низкомолекулярные заряженные вещества повышают стабильность белков и усиливают их способность к сворачиванию. К таким веществам относятся сахара, полиспирты, некоторые соли (такие, как сульфат аммония и хлорид магния), а так же некоторые аминокислоты (такие, как глицин и аланин). Одновременно они увеличивают компактность структуры и снижают подвижность белка. Понижение подвижности белка в присутствии таких стабилизаторов (например, сахарозы) было прямо показано с помощью методов изотопного обмена. В присутствии стабилизаторов, однако, увеличивается вероятность образования неправильно свернутых белков и агрегации. Их использование может дать преимущество, если денатурированные и промежуточные формы белка сохраняют растворимость и требуется значительное время для их правильного сворачивания. Так например, показано, что aльфа-синуклеин растворим в денатурированной форме и эффективность ренатурации повышается в присутствии стабилизатора триметиламин-N-оксида.

Иногда для борьбы с неправильным сворачиванием и агрегацией рекомбинантных белков белковым инженерам приходится изменять их первичную структуру, убирая "мешающие" аминокислотные остатки. В качестве примера такой задачи можно привести выполненную на нашей кафедре работу по модификации ингибитора рибонуклеазы барстара. Здесь, правда, нужно было устранить не грубую агрегацию продукта, а тонкую специфическую ассоциацию – образование димеров. Барстар – это небольшой белок (~ кДа), который, как оказалось относительно несложно получать – хороший уровень экспрессии, простая схема выделения и очистки. Но проблема возникла на другом этапе выяснилось, что правильно сложенный нативный барстар начинает димеризоваться в тех концентрациях, которые необходимы для проведения физико-химических исследований его структуры и динамики. Методом ЯМР были найдены константа димеризации, скорости образования и распада димера, а также выявлен участок димеризации. И тогда появилась идея изменить барстар - так, чтобы убрать эту димеризацию, не изменив при этом основные свойства белка. Т.е. была поставлена задача провести рациональный сайт-направленый мутагенез барстара с тем, чтобы уменьшить его склонность к димеризации, сохранив при этом пространственную структуру белка и его функцию (ингибитор рибонуклеазы). Анализ структуры димера показал, что белок димеризуется путем образования антипараллельной – структуры за счет гидрофобных взаимодействий между боковыми цепями остатков изолейцинов 86 и 87 и лейцина 88. Для решения задачи необходимо было нарушить межбелковые взаимодействия и сохранить взаимодействие внутри мономера. Анализ различных замен на интерфейсе димеризации методами молекулярного моделирования дал несколько возможных вариантов. Однако при экспрессии генов этих мутантов возникла другая проблема: такой белок перестал экспрессироваться! Почему? Возникло предположение, что это объясняется меньшей устойчивостью мутантов к внутриклеточным протеазам. А если так, то можно попытаться сохранить продукт, "прилепив" его к белкуносителю, т.е. путем гибридной экспрессии. Гибрид тиоредоксина и барстара был успешно получен, расщеплен энтерокиназой, и в результате был получен мутант изолейцин–87глутаминовая кислота, который сохранил структуру нативного белка, не димеризуется, стабилен и сохранил также свою функцию – образует прочный комплекс с рибонуклеазой барназой.

Контрольные упражнения, вопросы по содержанию раздела 1. В каких случаях необходимо ренатурировать рекомбинантные белки?

2. Что такое тельца включения?

3. Какие основные этапы включает процесс ренатурации рекомбинантного белка?

4. Почему нужно использовать сильные денатурирующие агенты?

5. Можно ли получить нативный белок в процессе ренатурации, не разрывая дисульфидных связей белка?

6. Каким образом можно понизить концентрацию денатуранта в процессе ренатурации рекомбинантного белка?

7. Искусственные белки с заданными свойствами.

Введение биологической активности в искусственные белки Конструирование искусственных белков или белков de novo, то есть абсолютно новых белковых конструкций с заданными свойствами – одна из наиболее амбициозных задач белковой инженерии. Очевидно, что полное понимание принципов построения структуры белков и ее связи с биологическими функциями белковых молекул подразумевает возможность создавать новые белки, и, в том числе, такие белки, которых нет (или они еще не обнаружены) в природе. Рассмотрим задачу создания искусственных белков на конкретном примере работы сотрудников нашей кафедры – конструирование искусственного белка альбебетина с заданной пространственной структурой и его биологически активных производных.

К настоящему времени в мире проведен дизайн десятков структур белков de novo, для части из них были химически синтезированы гены и эти белки удалось получить и исследовать. Практически все такие белки основывались на повторении природных белковых структур и, зачастую, на прямом использовании элементов их аминокислотных последовательностей. В то же время современная теория белковых структур, созданная в нашей стране О.Б.Птицыным и его школой, в принципе позволяет конструировать белки и с новой, то есть не обнаруженной до сих пор в природе архитектурой. Именно одна из таких белковых структур, показанная на рисунке 10, была выбрана для дизайна первого искусственного белка с новой архитектурой. Эта структура отвечает всем известным принципам формирования структуры глобулярных белков, в то же время в природных белках она не встречалась. Этот белок был назван альбебетином, так как он состоит из двух повторяющихся элементов альфа-бета-бета.

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра Конструирования и технологии одежды УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Системы конструирования одежды Основной образовательной программы по специальности 260902.65 Конструирование швейных изделий Благовещенск 2012 УМКД разработан доцентом кафедры Конструирования и технологии одежды Киселевой...»

«Оглавление Затраты времени обучающегося на изучение дисциплины Введение..3 1. Цель и задачи дисциплины..3 2. Место дисциплины в учебном процессе специальности.4 3. Перечень и содержание дисциплины. Лекционный курс.5 4. Перечень практических занятий.10 5. Перечень лабораторных работ..10 6. Учебно-методические материалы по дисциплине.11 7. Карта обеспеченности учебно-методической литературой.12 Приложение 1 Экзаменационные вопросы Приложение 2 Задание на курсовую работу Приложение 3 Методические...»

«Пояснительная записка Рабочая программа по географии составлена в соответствии с федеральным компонентом государственного стандарта общего образования, одобренный совместным решением коллегии Минобразования России и Президиума РАО от 23.12.2003 г. № 21/12 и утвержденный приказом Минобрнауки РФ от 05.03.2004 г. № 1089, инструктивно-методического письма О преподавании предмета География в общеобразовательных учреждениях Белгородской области в 2013-2014 учебном году. Примерная структура рабочей...»

«ЦЕНТР СОДЕЙСТВИЯ КОРЕННЫМ МАЛОЧИСЛЕННЫМ НАРОДАМ СЕВЕРА Н.В. Моралева, Е.Ю. Ледовских, Т. Келер, Д.В. Киричевский, М.Ю. Рубцова, В.П. Чижова АБОРИГЕННЫЙ ЭКОТУРИЗМ МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ Россия 2008 Ассоциация коренных малочисленных народов Центр содействия Севера, Сибири и Дальнего Востока коренным малочисленным народам Севера Российской Федерации ЦС КМНС АКМНССДВ РФ 119415, Москва, а/я 119415, Москва, а/я [email protected] [email protected] www.csipn.ru www.raipon.org Моралева Н.В., Ледовских Е.Ю.,...»

«УРАВНЕНИЯ ЛАГРАНЖА II РОДА Публикуется по учебному изданию Уравнения Лагранжа второго рода: методические указания к курсовому заданию по динамике / В.И.Дронг, Г.М.Максимов, А.И.Огурцов / под ред. В.В.Дубинина. – М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э.Баумана, 1985. _ 1. Груз 1 массой m1 скользит по наклонной плоскости, образующей угол с горизонтом. К грузу прикреплен конец нерастяжимой нити, которая переброшена через блок 4 и намотана на барабан 3 радиуса r, жестко соединенный с катком 2 радиуса R. Каток 2...»

«Министерство образования Российской Федерации _ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ НЕФТИ И ГАЗА им. И.М. ГУБКИНА КАФЕДРА АВТОМАТИЗАЦИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Е.Н. БРАГО, О.В. ЕРМОЛКИН Новые информационные технологии и измерительное оборудование контроля дебита скважин. Методические указания к практическим занятиям по дисциплине ИЗМЕРЕНИЕ И КОНТРОЛЬ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НЕФТЕГАЗОВЫХ ПРОИЗВОДСТВ Москва 2004 УДК 681.518+681.2:622.276. Браго Е.Н., Ермолкин О.В. Новые информационные...»

«Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Факультет вычислительной математики и кибернетики Волкова И.А. Введение в компьютерную лингвистику. Практические аспекты создания лингвистических процессоров (Учебное пособие для студентов факультета ВМиК МГУ) Москва 2006 УДК 519.6+681.3.06 Данное учебное пособие разработано в поддержку спецкурса Компьютерная лингвистика, читаемого на факультете ВМиК для студентов 3-5 курсов. Приводятся подробные пояснения и рекомендации. Рецензенты:...»

«Утверждена Приказом Министерства образования и науки Российской Федерации от 3 сентября 2009 г. N 323 (в ред. Приказа Минобрнауки РФ от 07.06.2010 N 588) СПРАВКА о наличии учебной, учебно-методической литературы и иных библиотечно-информационных ресурсов и средств обеспечения образовательного процесса, необходимых для реализации заявленных к лицензированию образовательных программ Раздел 2. Обеспечение образовательного процесса учебной и учебно-методической литературой по заявленным к...»

«Методические указания по внедрению и применению Санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества (утв. Главным государственным санитарным врачом от 20 декабря 1997 г.) МУ 2.1.4.682-97 Дата введения: с 1 января 1998 года См. также Методические рекомендации по обеспечению выполнения требований санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 Питьевая вода. Гигиенические требования к...»

«Организация работы по составлению предисловия к описи дел фондов, хранящихся в государственных, муниципальных и ведомственных архивах (методическое письмо) Информационно-методический бюллетень N 18 за 2002 г. от 01.06.2002 стр. 46 _ Лист l Организация работы по составлению предисловия к описи дел фондов, хранящихся в государственных,. муниципальных и ведомственных архивах (методическое письмо) Сорокина B.C. начальник отдела управления по делам архивов Правительства Хабаровского края Святенькая...»

«Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й КОМИТЕТ СССР ПО Н А Р О Д Н О М У О Б Р А З О В А Н И Ю УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ О Б Ъ Е Д И Н Е Н И Е ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИЧЕСКИХ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ / Ленинградский гидрометеорологический институт Одесский гидрометеорологический институт СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ПРОГНОЗЫ ПОГОДЫ Утверждено Ученым советом института в качестве учебного пособия ЛЕНИНГРАД 1991 У Д К 551.509.34 - ^,. Специализированные прогнозы погоды. Учебное пособие; Л., изд. ЛГМИ, 1991, 112 с. И з л а г а ю т с я...»

«Уважаемые выпускники! В перечисленных ниже изданиях содержатся методические рекомендации, которые помогут должным образом подготовить, оформить и успешно защитить выпускную квалификационную работу. Рыжков, И. Б. Основы научных исследований и изобретательства [Электронный ресурс] : [учебное пособие для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальностям) 280400 - Природообустройство, 280300 - Водные ресурсы и водопользование] / И. Б. Рыжков.- СанктПетербург [и др.] : Лань,...»

«MI,IH OFPHAYKIT POC CVTVI @e4epanbuo rocyAapcrBeHHoe e yqpex(AeHlre 6roANerHo o6pasonareJrbuoe e BbrcrrreroupoS eccr4 HElnburo o6pason auvrfl. o o (yxru Hc Krr fi rocyAa p crBeH Hbr fi TexH Hrrec Kr.r yH r{Bep curer) fi (yrry) "l$-,ffitfif,ID 6\hffiffi) p rro HayrrHofipa6ore oHHOfi AeflTenbHOCTH w{8* (("- B. E. Kyreuon 2011it|AP IIPOTPAMMA BCTyrrr4TenbH oro 3K3aMeHa B acrll4paHTypy n o cleqr4€urbHocTu 05.21.01 - TexsoJrorlrf, vrMarnr4Hbr Jreco3aroroBoK r4 JrecHofo xo3flficrsa IIo...»

«1 Количество названий/ сведения о грифах ВолгГТУ Вид литературы ВПИ КТИ Всего Плановые Заказные Учебная литература Учебники. 1/1 – – – 1/1 Учебные пособия. 67/19 7/3 14/14 31/5 119/41 Электронные аналоги печатных изданий. 26/0 – 40/0 – 66/0 Научная литература Известия ВолгГТУ. 12 3 – – 15 Сборники трудов научных конференций. 5 1 2 2 Монографии (ИУНЛ и др. изд-ва). 43 – 6 1 108 66 119 Учебно-методическая литература. СОДЕРЖАНИЕ Тематический план ВолгГТУ.. Учебная литература.. Научная...»

«(ПРОЕКТ, НЕ УТВЕРЖДЁН) МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНВЕСТИЦИОННЫХ ПРОЕКТОВ _ (Третья редакция, исправленная и дополненная) Москва - 2008 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ (не утверждены, проект) Рекомендации разработаны авторским коллективом в составе: Руководители: В.В.Коссов, В.Н.Лившиц, А.Г.Шахназаров. Участники: Н.Г.Алешинская, П.Л.Виленский, И.А.Никонова, А.А.Первозванский, Г.П.Писчасов, Н.Я.Рябикова, С.А.Смоляк, В.П.Трофимов. 2 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ (не утверждены,...»

«Развертки комбинированных поверхностей вращения Методические указания для студентов направлений подготовки 262000 Технология изделий легкой промышленности, 262200 Конструирование изделий легкой промышленности Иваново 2012 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ивановская государственная текстильная академия (ИГТА) Кафедра инженерной графики Развертки комбинированных поверхностей...»

«Санкт-Петербургский государственный университет Высшая школа менеджмента МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПОДГОТОВКЕ КУРСОВЫХ РАБОТ ПО ПРОФИЛЮ ПОДГОТОВКИ НА БАКАЛАВРСКОЙ ПРОГРАММЕ ПО НАПРАВЛЕНИЮ 080500 – МЕНЕДЖМЕНТ Составители: доц. Баранов И.Н., доц. Зенкевич Н.А., доц. Федотов Ю.В. Печатается по решению учебно-методической комиссии Высшей школы менеджмента СПбГУ Санкт-Петербург 2009 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Подготовка и защита курсовой работы по профилю подготовки (далее – курсовая работа) является...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина Институт государственного управления и предпринимательства МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО НАПИСАНИЮ И ОФОРМЛЕНИЮ КОНТРОЛЬНЫХ И КУРСОВЫХ РАБОТ, ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ БАКАЛАВРА, ДИПЛОМНОГО ПРОЕКТА СПЕЦИАЛИСТА, МАГИСТЕРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ Екатеринбург 2012...»

«Методические указания по ведению бюджетного учета и составлению бюджетной отчетности финансовых органов Содержание ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 2. БЮДЖЕТНЫЙ УЧЕТ В ФИНАНСОВЫХ ОРГАНАХ 2.1. Учет средств на счетах бюджетов 2.1.1. Счет 0.202.00.000 Средства на счетах бюджетов. 2.1.2. Счет 0.202.01.000 Средства единого счета бюджета. 2.1.3. Счет 0.202.02.000 Средства бюджета в пути. 2.1.4. Счет 0.202.03.000 Средства бюджета в иностранной валюте.37 2.1.5. Отражение показателей остатков и оборотов по...»

Курсовая работа

по дисциплине: Сельскохозяйственная биотехнология

на тему: «Белковая инженерия»

Введение. Белковая инженерия

2 Стратегии белковой инженерии. Примеры инженерных белков. Применение белковой инженерии

1 Библиотеки пептидов и эпитопов

2 Белки-репортеры в гибридных белках

3 Некоторые достижения белковой инженерии.

Заключение

Список литературы

Реферат

Тема работы: Белковая инженерия.

Ключевые слова: биотехнология, генная инженерия, белок, генетический код, ген, ДНК, РНК, АТФ, пептиды, эпитоп.

Цель курсовой работы: изучение понятия «белковая инженерия» и потенциальных возможностей её использования.

Потенциальные возможности белковой инженерии:

Изменив прочность связывания преобразуемого вещества - субстрата - с ферментом, можно повысить общую каталитическую эффективность ферментативной реакции.

Повысив стабильность белка в широком диапазоне температур и кислотности среды, можно использовать его в условиях, при которых исходный белок денатурирует и теряет свою активность.

Создав белки, способные функционировать в безводных растворителях, можно осуществлять каталитические реакции в нефизиологических условиях.

Изменив каталитический центр фермента, можно повысить его специфичность и уменьшить число нежелательных побочных реакций

Повысив устойчивость белка к расщепляющим его ферментам, можно упростить процедуру его очистки.

Изменив белок таким образом, чтобы он мог функционировать без обычного для него не аминокислотного компонента (витамина, атома металла и т.п.), можно использовать его в некоторых непрерывных технологических процессах.

Изменив структуру регуляторных участков фермента, можно уменьшить степень его торможения продуктом ферментативной реакции по типу отрицательной обратной связи и тем самым увеличить выход продукта.

Можно создать гибридный белок, обладающий функциями двух и более белков.

Можно создать гибридный белок, один из участков которого облегчает выход гибридного белка из культивируемой клетки или извлечение его из смеси.

Введение

С незапамятных времен биотехнология применялась преимущественно в пищевой и легкой промышленности: в виноделии, хлебопечении, сбраживании молочных продуктов, при обработке льна и кож, основанных на применении микроорганизмов. В последние десятилетия возможности биотехнологии необычайно расширились. Это связано с тем, что ее методы выгоднее обычных по той простой причине, что в живых организмах биохимические реакции, катализируемые ферментами, идут при оптимальных условиях (температуре и давлении), более производительны, экологически чисты и не требуют химических реактивов, отравляющих среду .

Объектами биотехнологии являются многочисленные представители групп живых организмов - микроорганизмы (вирусы, бактерии, простейшие, дрожжевые грибы), растения, животные, а также изолированные из них клетки и субклеточные компоненты (органеллы) и даже ферменты. Биотехнология базируется на протекающих в живых системах физиолого-биохимических процессах, в результате которых осуществляются выделение энергии, синтез и расщепление продуктов метаболизма, формирование химических и структурных компонентов клетки.

Главным направлением биотехнологии является производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферменты, витамины, гормоны), лекарственных препаратов (антибиотики, вакцины, сыворотки, высокоспецифичные антитела и др.), а также ценных соединений (кормовые добавки, например, незаменимые аминокислоты, кормовые белки и т. д.).

Методы генетической инженерии позволили осуществить синтез в промышленных количествах таких гормонов, как инсулин и соматотропин (гормон роста), которые необходимы для лечения генетических болезней человека.

Биотехнология решает не только конкретные задачи науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача - она расширяет и ускоряет масштабы воздействия человека на живую природу и способствует адаптации живых систем к условиям существования человека, т. е. к ноосфере. Биотехнология, таким образом, выступает в роли мощного фактора антропогенной адаптивной эволюции.

У биотехнологии, генетической и клеточной инженерии многообещающие перспективы. При появлении все новых и новых векторов человек с их помощью будет внедрять нужные гены в клетки растений, животных и человека. Это позволит постепенно избавиться от многих наследственных болезней человека, заставить клетки синтезировать необходимые лекарства и биологически активные соединения, а затем - непосредственно белки и незаменимые аминокислоты, употребляемые в пищу. Используя методы, уже освоенные природой, биотехнологи надеются получать с помощью фотосинтеза водород - самое экологически чистое топливо будущего, электроэнергию, превращать в аммиак атмосферный азот при обычных условиях .

Физические и химические свойства природных белков часто не удовлетворяют условиям, в которых эти белки будут использоваться человеком. Требуется изменение его первичной структуры, которое обеспечит формирование белка с иной, чем прежде, пространственной структурой и новыми физико-химическими свойствами, позволяющими и в иных условиях выполнять присущие природному белку функции. Конструированием белков занимается белковая инженерия .

Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей.

Для получения измененного белка используют методы комбинаторной химии и осуществляют направленный мутагенез - внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях. Для эффективного конструирования белка с заданными свойствами необходимо знать закономерности формирования пространственной структуры белка, от которой зависят его физико-химические свойства и функции, то есть необходимо знать, как первичная структура белка, каждый его аминокислотный остаток влияет на свойства и функции белка. К сожалению, для большинства белков неизвестна третичная структура, не всегда бывает известно, какую именно аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными свойствами. Уже сейчас ученые с помощью компьютерного анализа могут предсказывать свойства многих белков, исходя из последовательности их аминокислотных остатков. Подобный анализ значительно упростит процедуру создания нужных белков. Пока же для того, чтобы получить измененный белок с нужными свойствами, идут в основном иным путем: получают несколько мутантных генов и находят тот белковый продукт одного из них, который обладает нужными свойствами.

Для направленного мутагенеза используют разные экспериментальные подходы. Получив измененный ген, его встраивают в генетическую конструкцию и вводят ее в прокариотические или эукариотические клетки, осуществляющие синтез белка, кодируемого этой генетической конструкцией .

I. Белковая инженерия

.1 Понятие белковой инженерии. История развития

Белковая инженерия (англ. Protein engineering) - раздел биотехнологии, который занимается разработкой полезных или ценных белков. Это относительно новая дисциплина, которая направлена на исследование фолдинга белков и принципов модификации и создания белков.

Существуют две основные стратегии для белковой инженерии: направленная модификация белка и направленная эволюция. Эти методы не являются взаимоисключающими; исследователи часто применяют оба. В будущем, более детальное знание структуры и функции белков, а также достижения в области высоких технологий, может значительно расширить возможности белковой инженерии. В итоге, даже неприродные аминокислоты могут быть включены благодаря новому методу, который позволяет включать новые аминокислоты в генетический код .

Белковая инженерия зародилась на стыке физики и химии белка и генетической инженерии. Она решает задачу создания модифицированных или гибридных молекул белков с заданными характеристиками. Естественным путем реализации такой задачи является предсказание структуры гена, кодирующего измененный белок, осуществление его синтеза, клонирования и экспрессии в реципиентных клетках .

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы - субтилизина они применили метод химической модификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность.

Белок в химическом отношении представляет собой однотипную молекулу, которая является полиаминокислотной цепочкой или полимером. Составлен он из аминокислотных последовательностей 20 типов. Узнав строение белков, люди задались вопросом: можно ли спроектировать абсолютно новые аминокислотные последовательности, чтобы они выполняли нужные человеку функции гораздо лучше, чем обычные белки? Для данной идеи подошло название Белковая инженерия .

О такой инженерии стали задумываться ещё в 50-е годы XX столетия. Случилось это сразу же после расшифровки первых белковых аминокислотных последовательностей. Во многих лабораториях мира начали делать попытки дублировать природу и синтезировать химическим путём заданные абсолютно произвольно полиаминокислотные последовательности.

Больше всех в этом преуспел химик Б. Меррифилд. Этому американцу удалось разработать чрезвычайно эффективный метод синтеза полиаминокислотных цепей. За это Меррифилду в 1984 году присудили Нобелевскую премию по химии.

Рисунок 1. Схема функционирования белковой инженерии

Американец начал синтезировать короткие пептиды, включая гормоны. При этом построил автомат - «химического робота» - в задачу которого входило производит искусственные белки. Робот вызвал сенсацию в научных кругах. Однако скоро выяснилось, что его продукция не может конкурировать с тем, что производит природа.

Робот не мог в точности воспроизводить аминокислотные последовательности, то есть ошибался. Он синтезировал одну цепь с одной последовательностью, а другую уже с немного изменённой. В клетке же все молекулы одного белка идеально похожи друг на друга, то есть их последовательности абсолютно одинаковые.

Была и другая проблема. Даже те молекулы, которые робот синтезировал правильно, не принимали ту пространственную форму, которая необходима для функционирования фермента. Таким образом, попытка подменить природу обычными методами органической химии привела к весьма скромному успеху.

Учёным оставалось учиться у природы, выискивая нужные модификации белков. Тут дело в том, что в природе постоянно идут мутации, ведущие к изменению аминокислотных последовательностей белков. Если отобрать мутантов с необходимыми свойствами, более эффективно перерабатывающих тот или иной субстрат, то можно выделить из такого мутанта измененный фермент, благодаря которому клетка приобретает новые свойства. Но данный процесс занимает очень большой период времени.

Все изменилось тогда, когда появилась генная инженерия. Благодаря ей, стали создавать искусственные гены с любой последовательностью нуклеотидов. Эти гены встраивали в приготовленные молекулы-векторы и внедряли эти ДНК в бактерии или дрожжи. Там с искусственного гена снималась копия РНК. В результате этого вырабатывался нужный белок. Ошибки в его синтезе исключались. Главное, надо было подобрать нужную последовательность ДНК, а дальше уже ферментная система клетки сама безупречно делала своё дело. Таким образом, можно заключить, что генная инженерия открыла путь белковой инженерии в самой радикальной форме .

1.2 Стратегии белковой инженерии

Направленная модификация белка. При направленной модификации белка ученый использует детальное знание структуры и функции белка, чтобы внести нужные изменения. Как правило, этот метод имеет то преимущество, что он недорогой и технически несложный, так как техника сайт-направленного мутагенеза хорошо развита. Однако, его основным недостатком является то, что сведения о подробной структуре белка часто отсутствуют, и даже когда структура известна, может быть очень трудно предсказать влияние различных мутаций.

Программные алгоритмы модификации белка стремятся к выявлению новых аминокислотных последовательностей, которые требуют мало энергии для формирования предопределенной целевой структуры. В то время как последовательность, которая должно быть найдена, велика, наиболее сложным требованием для модификации белка является быстрый, но точный, способ для выявления и определения оптимальной последовательности, в отличие ее от аналогичных субоптимальных последовательностей .

Направленная эволюция. В направленной эволюции случайный мутагенез применяется к белку и селекция идет так, чтобы выбрать варианты, которые имеют определенные качества. Далее применяются еще раунды мутации и селекции. Этот метод имитирует естественную эволюцию и в целом позволяет получить превосходные результаты для направленной модификации.

Дополнительный метод, известный как ДНК-перетасовки, смешивает и выявляет части удачных вариантов для получения лучших результатов. Этот процесс имитирует рекомбинации, которые происходят естественно во время полового размножения. Преимуществом направленной эволюции является то, что она не требует предварительных знаний о структуре белка, да и не нужно, чтобы иметь возможность прогнозировать, какое влияние данная мутация будет иметь. В самом деле, результаты экспериментов направленной эволюции удивляют, поскольку желаемые изменения часто бывают вызваны мутациями, которые не должны были иметь такой эффект. Недостатком является то, что этот метод требует высокой пропускной способности, который не представляется возможным для всех белков. Большое количество рекомбинантной ДНК должно быть мутированным и необходимо провести скрининг продуктов на выявление желаемого качества. Огромное количество вариантов часто требует покупки робототехники для автоматизации процесса. Кроме того, не всегда легко провести скрининг на выявление всех интересующих качеств .

II. Примеры инженерных белков

Белковая инженерия может быть основана на химической модификации готового белка или на методах генетической инженерии, позволяющих получать модифицированные варианты природных белков .

Конструирование определенного биологического катализатора ведется с учетом как специфичности белка, так и каталитической активности металлоорганического комплекса. Вот примеры такой модификации, проведенной для получения «полусинтетических биоорганических комплексов». Миоглобин кашалота способен связывать кислород, но не обладает биокаталитической активностью. В результате объединения этой биомолекулы с тремя электрон-переносящими комплексами, содержащими рутений, которые связываются с остатками гистидина на поверхности молекул белка, образуется комплекс, способный восстанавливать кислород при одновременном окислении ряда органических субстратов, например аскорбата, со скоростью почти такой же, как для природной аскорбатоксидазы. В принципе белки можно модифицировать и другими способами. Рассмотрим, например, папаин. Он относится к числу хорошо изученных протеолитических ферментов, для которого определена трехмерная структура. Поблизости от остатка цистеина-25 на поверхности белковой молекулы располагается протяженный желобок, в котором протекает реакция протеолиза. Этот участок может быть алкилирован производным флавина без изменения доступности участка связывания потенциальных субстратов. Такие модифицированные флавопапаины использовались для окисления М-алкил-1,4-дигидроникотинамидов, и каталитическая активность некоторых из этих модифицированных белков была существенно выше, чем у природных флавопротеин-NADH-дегидрогеназ. Таким образом удалось создать очень эффективный полусинтетический фермент. Использование флавинов с высокоактивными, находящимися в определенном положении электрон-оттягивающими заместителями, возможно, позволит разработать эффективные катализаторы для восстановления никотин-амида.

Крупные успехи, достигнутые за последнее время в химическом синтезе ДНК, открыли перед белковой инженерией принципиально новые возможности: конструирование уникальных, не встречающихся в природе белков. Для этого необходимо и дальнейшее развитие технологии, так чтобы изменение генов методами генетической инженерии приводило к предсказуемым изменениям белков, к улучшению вполне определенных функциональных их характеристик: числа оборотов, Км для конкретного субстрата, термостабильности, температурного оптимума, стабильности и активности в неводных растворителях, субстратной и реакционной специфичности, потребности в кофакторах, оптимуме рН, устойчивости к протеазам, аллостерической регуляции, молекулярной массы и субъединичного строения. Обычно такого улучшения достигали с помощью мутагенеза и отбора, а в последнее время - путем химической модификации и иммобилизации. Для успешного конструирования конкретного типа молекул белка необходимо выявить ряд основополагающих закономерностей, связывающих структурные особенности белков и их желаемые свойства. Так, зная точную кристаллическую структуру молекулы изучаемого белка, можно идентифицировать те ее участки, которые следует направленно модифицировать для увеличения его каталитической активности. Такая модификация может состоять в изменении аминокислотной последовательности белка .

Ещё одним примером может служить осуществление сайт-специфического мутагенеза. Он происходит следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подходящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти - пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов.

Тирозил-тРНК-синтетаза катализирует реакцию аминоацилирования тирозиновой тРНК, которая включает активирование тирозина с помощью АТР с образованием тирозиладенилата. Ген этого фермента, выделенный из Bacillus stearothermophilus, был встроен в бактериофаг М13. Затем каталитические свойства фермента, особенно его способность связывать субстрат, были изменены путем сайт-специфической модификации. Так, треонин-51 был заменен на аланин. Это привело к двукратному увеличению связывания субстрата, видимо, из-за невозможности образования водородной связи между этим остатком и тирозил-аденилатом. При замене аланина пролином нарушается конфигурация молекулы фермента, но способность к связыванию субстрата увеличивается в сто раз, так как облегчается его взаимодействие с гистидином-48. Сходные сайт-специфичные изменения, были получены в р-лактамазе, и обычно они сопровождались инактивацией фермента. Замена серина-70 на цистеин приводит к образованию р-тиоллактамазы, константа связывания у которой не отличается от таковой для природного фермента, но активность по отношению к пенициллину составляет всего 1-2%. Тем не менее активность этого мутантного фермента в отношении некоторых активированных цефалоспоринов не меньше исходной активности или даже превышает ее; эти белки также более устойчивы к действию протеаз.

Мутации, вызываемые путем сайт-специфичного воздействия, используют сегодня для проверки адекватности результатов структурных исследований. В некоторых случаях с их помощью удалось показать, что структурная стабильность белка и его каталитическая активность могут быть разобщены. Накопилось достаточное количество информации о взаимосвязи между стабильностью структуры белка и его функцией, мы, возможно, сумеем осуществлять тонкую регуляцию активности биологических катализаторов и создавать полностью синтетические их аналоги. Недавно появилась работа, в которой сообщалось о клонировании первого синтетического гена фермента, кодирующего активный фрагмент молекулы рибонуклеазы .

III. Применение белковой инженерии

Технология белковой инженерии используется (часто - в сочетании с методом рекомбинантных ДНК) для улучшения свойств существующих белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создания новых, не существующих в природе протеинов. Такие белки применяются для создания лекарственных препаратов, при обработке пищевых продуктов и в промышленном производстве .

Однако некоторые характеристики биокатализаторов делают их использование в ряде случаев неприемлемым. Например, большинство ферментов распадается при повышении температуры. Ученые пытаются преодолеть подобные препятствия и увеличить стабильность ферментов в суровых условиях производства с помощью методов белковой инженерии .

Кроме промышленного применения, белковая инженерия нашла себе достойное место и в медицинских разработках. Исследователи синтезируют белки, способные связываться с вирусами и мутантными генами, вызывающими опухоли, и обезвреживать их; создают высокоэффективные вакцины и изучают белки-рецепторы клеточной поверхности, которые часто являются мишенями для фармацевтических препаратов. Ученые, занимающиеся усовершенствованием продуктов питания, используют белковую инженерию для улучшения качеств белков, обеспечивающих сохранность продуктов растительного происхождения, а также желирующих веществ или загустителей.

Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей .

3.1 Библиотеки пептидов и эпитопов

В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция транскрипции генов под действием различных белковых факторов, взаимодействие белковых лигандов с рецепторами на поверхности клеток, а также специфическое связывание антигенов соответствующими антителами. Понимание молекулярных механизмов взаимодействия белковых лигандов с рецепторами имеет большое фундаментальное и прикладное значение. В частности, разработка новых лекарственных препаратов белковой природы обычно начинается с идентификации исходной последовательности аминокислот, обладающей требуемой биологической активностью (так называемая "основная" (lead) последовательность). Однако пептиды с основной последовательностью аминокислот могут обладать и нежелательными биологическими свойствами: низкой активностью, токсичностью, малой стабильностью в организме и т.п.

До появления библиотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию библиотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления среди них пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие библиотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например антителам .

По способам получения библиотеки пептидов разделяются на три группы. К первой группе можно отнести библиотеки, полученные с использованием химического синтеза пептидов, в которых индивидуальные пептиды иммобилизованы на микроносителях. При таком подходе после присоединения очередных аминокислот в индивидуальных реакционных смесях к пептидам, иммобилизованным на микроносителях, содержимое всех реакционных смесей объединяют и разделяют на новые порции, которые используют на следующей стадии присоединения новых аминокислотных остатков. После проведения ряда таких этапов оказываются синтезированными пептиды, содержащие последовательности использованных в синтезе аминокислот во всевозможных случайных сочетаниях.

Библиотеки пептидов, иммобилизованных на микроносителях, обладают существенным недостатком: они требуют при скрининге использования очищенных рецепторов, находящихся в растворимой форме. В то же время в большинстве случаев при биологических испытаниях, проводящихся для фундаментальных и фармакологических исследований, чаще всего находят применение рецепторы, ассоциированные с мембранами. По второму способу библиотеки пептидов получают с помощью твердофазного синтеза пептидов, при котором на каждой стадии химического присоединения очередной аминокислоты к растущим пептидным цепям используют эквимолярные смеси всех или некоторых аминокислот-предшественников. На конечной стадии синтеза проводят отделение пептидов от носителя, т.е. перевод их в растворимую форму. Третий подход к конструированию библиотек пептидов, к описанию которого мы сейчас переходим, стал реальным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Он прекрасно иллюстрирует возможности таких методов и, несомненно, является крупным достижением в их применении. В этой связи рассмотрим более подробно результаты использования библиотек пептидов в исследовании эпитопов (антигенных детерминант) белков .

Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, библиотеки пептидов, полученные генно-инженерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Два недавно сделанных наблюдения позволяют рассматривать библиотеку пептидов одновременно и в качестве библиотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образуемые между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд-рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую библиотеку пептидов - как библиотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов.

Библиотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению методами генной инженерии в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. (Данный метод известен под названием фагового дисплея.) В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на N- или С-концах которых присутствуют дополнительные последовательности аминокислот.

Библиотеки пептидов и эпитопов найдут свое применение и в исследованиях механизмов гуморального иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы. В частности, большинство аутоиммунных заболеваний сопровождается образованием аутоантител против антигенов собственного организма. Эти антитела во многих случаях служат специфическими маркерами того или иного аутоиммунного заболевания. С использованием библиотеки эпитопов, в принципе, можно получить пептидные маркеры, с помощью которых было бы возможно следить за специфичностью аутоантител во время развития патологического процесса как в индивидуальном организме, так и в группе пациентов и, кроме того, определять специфичность аутоантител при заболеваниях неизвестной этиологии.

Библиотеки пептидов и эпитопов потенциально могут быть использованы также для скрининга иммунных сывороток с целью выявления пептидов, специфически взаимодействующих с защитными антителами. Такие пептиды будут имитировать антигенные детерминанты патогенных организмов и служить мишенями для защитных антител организма. Это позволит использовать подобные пептиды для вакцинации пациентов, у которых отсутствуют антитела против соответствующих патогенов. Изучение эпитопов с помощью библиотек пептидов является частным случаем одного из многочисленных направлений их использования в прикладных и фундаментальных исследованиях взаимодействия лигандов и рецепторов. Дальнейшее усовершенствование этого подхода должно способствовать созданию новых лекарственных препаратов на основе коротких пептидов и быть полезным в фундаментальных исследованиях механизмов белок-белковых взаимодействий .

3.2 Белки-репортеры в гибридных белках

В другом случае гибридные белки применяют для получения высокого уровня экспрессии коротких пептидов в бактериальных клетках благодаря стабилизации этих пептидов в составе гибридных белков. Часто гибридные белки используют для идентификации и очистки трудноопределяемых рекомбинантных белков. Например, присоединив к С-концу исследуемого белка в качестве белка-репортера галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности галактозидазы, определяя ее антигенные детерминанты иммунохимическими методами. Соединяя фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, можно очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Полученные антитела далее применяют для очистки нативного белка, в состав которого входит рекомбинантный полипептид, кодируемый ОРС, и тем самым идентифицируют клонированный фрагмент гена .

С помощью гибридных белков решают и обратную задачу клонирования неизвестного гена, к белковому продукту которого имеются антитела. В таком случае конструируют клонотеку последовательностей нуклеотидов, представляющих ОРС неизвестных генов, в векторах, которые позволяют соединять клонируемую ОРС в одной рамке считывания с геном-репортером. Образующиеся в результате экспрессии этих рекомбинантных генов гибридные белки идентифицируются с помощью антител иммуноферментными методами. Гибридные гены, объединяющие секретируемые белки и белки-репортеры, дают возможность по-новому исследовать механизмы секреции, а также локализацию и перемещение в тканях секретируемых белков .

3.3 Некоторые достижения белковой инженерии

Заменив несколько аминокислотных остатков лизоцима бактериофага Т4 на цистеин получен фермент с большим числом дисульфидных связей, благодаря чему этот фермент сохранил свою активность при более высокой температуре.

Замена остатка цистеина на остаток серина в молекуле р-интерферона человека, синтезируемого кишечной палочкой, предотвращала образование межмолекулярных комплексов, при котором примерно в 10 раз уменьшалась противовирусная активность этого лекарственного средства.

Замена остатка треонина на остаток пролина в молекуле фермента тирозил-тРНК-синтетазы повысило каталитическую активность этого фермента в десятки раз: он стал быстрее присоединять тирозин к тРНК, переносящей эту аминокислоту в рибосому в ходе трансляции.

Субтилизины - богатые серином ферменты, расщепляющие белки. Они секретируются многими бактериями и широко используются человеком для биодеградации. Они прочно связывают атомы кальция, повышающие их стабильность. Однако в промышленных процессах присутствуют химические соединения, которые связывают кальций, после чего субтилизины теряют свою активность. Изменив ген, ученые удалили из фермента аминокислоты, участвующие в связывании кальция, и заменили одну аминокислоту на другую с целью повышения стабильности субтилизина. Измененный фермент оказался стабильным и функционально активным в условиях, близких к промышленным.

Была показана возможность создания фермента, функционирующего по типу рестриктаз, расщепляющих ДНК в строго определенных местах. Ученые создали гибридный белок, один фрагмент которого узнавал определенную последовательность нуклеотидных остатков в молекуле ДНК, а другой расщеплял ДНК в этом участке.

Активатор тканевого плазминогена - фермент, который используют в клинике для растворения сгустков крови. К сожалению, он быстро выводится из системы кровообращения и его приходится вводить повторно или в больших дозах, что приводит к побочным эффектам. Внеся три направленные мутации в ген этого фермента, получили долгоживущий фермент, обладающий повышенным сродством к разрушаемому фибрину и с такой же фибринолитической активностью, как у исходного фермента.

Произведя замену одной аминокислоты в молекуле инсулина, ученые добились того, что при подкожном введении этого гормона больным, страдающим диабетом, изменение концентрации этого гормона в крови было близко к физиологическому, возникающему после приема пищи.

Существует три класса интерферонов, обладающих противовирусной и противораковой активностью, но проявляющих разную специфичность. Заманчиво было создать гибридный интерферон, обладающий свойствами интерферонов трех типов. Были созданы гибридные гены, включающие в себя фрагменты природных генов интерферонов нескольких типов. Часть этих генов, будучи встроенными в бактериальные клетки, обеспечивали синтез гибридных интерферонов с большей, чем у родительских молекул, противораковой активностью.

Природный гормон роста человека связывается не только с рецептором этого гормона, но и с рецептором другого гормона - пролактина. Для того, чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, ученые решили устранить возможность присоединения гормона роста к пролактиновому рецептору. Они добились этого, заменив некоторые аминокислоты в первичной структуре гормона роста с помощью генетической инженерии.

Разрабатывая средства против ВИЧ-инфекции, ученые получили гибридный белок, один фрагмент которого обеспечивал специфическое связывание этого белка только с пораженными вирусом лимфоцитами, другой фрагмент осуществлял проникновение гибридного белка внутрь пораженной клетки, а еще один фрагмент нарушал синтез белка в пораженной клетке, что приводило к ее гибели.

Белки являются основной мишенью для лекарственных средств. Сейчас известно около 500 мишеней для действия лекарств. В ближайшие годы их число возрастет до 10 000, что позволит создать новые, более эффективные и безопасные лекарства. В последнее время разрабатываются принципиально новые подходы поиска лекарственных средств: в качестве мишеней рассматриваются не одиночные белки, а их комплексы, белок -белковые взаимодействия и фолдинг белков .

Заключение

Технология белковой инженерии используется (часто - в сочетании с методом рекомбинантных ДНК) для улучшения свойств существующих белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создания новых, не существующих в природе протеинов. Такие белки применяются для создания лекарственных препаратов, при обработке пищевых продуктов и в промышленном производстве.

В настоящее время наиболее популярной областью применения белковой инженерии является изменение каталитических свойств ферментов для разработки «экологически дружественных» промышленных процессов. С точки зрения охраны окружающей среды ферменты являются наиболее приемлемыми из всех катализаторов, используемых в промышленности. Это обеспечивается способностью биокатализаторов растворяться в воде и полноценно функционировать в среде с нейтральным рН и при сравнительно низких температурах. Кроме того, благодаря их высокой специфичности, в результате применения биокатализаторов образуется совсем немного нежелательных побочных продуктов производства. Экологически чистые и энергосберегающие промышленные процессы, использующие биокатализаторы, уже давно активно внедряются химической, текстильной, фармацевтической, целлюлозно-бумажной, пищевой, энергетической и других областях современной промышленности.

Однако некоторые характеристики биокатализаторов делают их использование в ряде случаев неприемлемым. Например, большинство ферментов распадается при повышении температуры. Ученые пытаются преодолеть подобные препятствия и увеличить стабильность ферментов в суровых условиях производства с помощью методов белковой инженерии.

Кроме промышленного применения, белковая инженерия нашла себе достойное место и в медицинских разработках. Исследователи синтезируют белки, способные связываться с вирусами и мутантными генами, вызывающими опухоли, и обезвреживать их; создают высокоэффективные вакцины и изучают белки-рецепторы клеточной поверхности, которые часто являются мишенями для фармацевтических препаратов. Ученые, занимающиеся усовершенствованием продуктов питания, используют белковую инженерию для улучшения качеств белков, обеспечивающих сохранность продуктов растительного происхождения, а также желирующих веществ или загустителей.

Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей .

белок инженерия мутагенез модифицированный

Список литературы

1. Белковая инженерия.

2. Белковая инженерия. Загадки генетики. /Вячеслав Маркин // Тайны, загадки, факты.

Белковая инженерия. // Большая Российская энциклопедия.

Белковая инженерия. // Справочник химика 21.

Белковая инженерия и эффективность лекарств.

Белковая инженерия. / А.И. Корнелюк // Biopolymers and Cell.

Белковая инженерия повысит эффективность лекарств. // Популярная механика.

Белковая инженерия. Получение инсулина. // Биофайл - научно-информационный журнал.

Биотехнология. Основные направления и достижения. // Биология для абитуриентов и учителей.

Богданов А.А., Медников Б.М. Власть над геном / А. А. Богданов, Б.М. Медников - М.: Просвещение, 1989 - с.208

Генная инженерия. // Здравие.

Гены и химики. // Генетика.

13. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. - М.: Мир, 2002.

14. Другие области применения генной инженерии. / Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик // Медицина - новости и технологии.

15. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухин Е.А. Основы биотехнологии. / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухин - М., 2003.

16. Инженерия белка. // Химия и биотехнология.

17. Патрушев Л.И. Экспрессия генов/ Л.И. Патрушев - М.: Наука, 2000. - 496с.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т. 1: Генная и белковая инженерия. /Л.И. Патрушев - М.: Наука, 2004. - 526 с.

Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: Учебник для вузов/В.Н. Рыбчин - СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. - 522 с.

Степанов В.М. Молекулярная биология. Структуры и функции белков. / В.М. Степанов - М.: Высшая Школа, 1996.

Технологии биотехнологии: белковая инженерия, нанобиотехнология, биосенсоры и биочипы. / Евгения Рябцева // «Коммерческая биотехнология» - интернет-журнал.

Чернавский Д.С., Чернавская Н.М. Белок-машина. Биологические макромолекулярные конструкции. / Д.С. Чернавский, Н. М. Чернавская - М.: Изд-во МГУ, 1999.

Шульц Г.Е., Ширмер Р.Х. Принципы структурной организации белков. / Г.Е. Шульц, Р.Х. Ширмер - М.: Мир, 1982.

24. Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12;

25. Protein engineering. // Wikipedia, the free encyclopedia.